基于响应面法优化紫花地丁多酚与黄酮的提取工艺

顾生玖，姚志仁，顾超豪，李豫，唐辉，谢鹏，朱开梅*

（1.桂林医学院药学院，广西 桂林 541100；2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西 桂林 541100；3.广西科伦制药有限公司，广西 桂林 541100）

紫花地丁（Viola philippica），堇菜科堇菜属草本植物，在我国分布广泛，除青海、西藏外均有生长[1-2]。春夏秋均可采收，资源丰富[3]。其功效有凉血、解毒、消肿等，具有长久的民间用药史，临床价值较高[4-6]。现代临床用途主要有疔疮肿毒、尿路感染、咽炎等[7]。

紫花地丁中含有多种成分，如黄酮类、糖类、苷类、氨基酸等[8-9]。据国内外文献报道，其有良好的抑菌、抗炎、降脂等功效作用，在食品、医药行业具有良好的应用前景[10]。鉴于对紫花地丁总黄酮、多酚类研究报告较少，本试验采用一种更合理的试验设计方法——响应面法，优化超声波辅助提取技术对紫花地丁多酚、黄酮技术，为深入开发紫花地丁提供科学依据[11]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫花地丁：中国科学院广西植物研究所提供，经唐辉研究员鉴定为紫花地丁正品；氢氧化钠、无水碳酸钠、亚硝酸钠、无水乙醇、硝酸铝（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司；芦丁、没食子酸标准品：国家食品药品检定研究院；福林酚：美国Sigma公司。

FA2204B型精密电子天平：上海越平科学仪器制造有限公司；750A型多功能粉碎机：永康市红太阳机电有限公司；DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；ReadMax 1900型全波长Epoch酶标仪：上海闪谱生物科技有限公司；N-1300D型EYELA旋转蒸发仪：上海巴玖实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制方法

1.2.1.1 多酚标准曲线的绘制

参考文献[12]方法并做修改，称取适量干燥没食子酸标准品，纯水稀释，配制成0.02 mg/mL没食子酸标准溶液[13]，并参照国标法操作，依次吸取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.25 mL 的标准溶液，并测定 760 nm 处吸光度。

1.2.1.2 黄酮标准曲线的绘制

参考文献[14-16]的方法，并做修改，称取适量干燥槲皮素标准品，纯水稀释，制备为0.125 mg/mL标准溶液。依次吸取标准液 0、2、4、6、8、10mL 于 25mL 容量瓶中，加入0.7 mL含5%的亚硝酸钠溶液，轻微摇匀，无明显变色现象，静置5min，加入0.7mL含10%的硝酸铝溶液，摇匀颜色变浅，放置5min后，加入5mL含20%的氢氧化钠溶液，溶液变为红色，再加60%乙醇定容至刻度线，轻微晃匀，静置15 min，测定510nm处吸光度[17-18]。

1.2.2 提取工艺流程

紫花地丁多酚黄酮提取工艺流程见图1。

图1 紫花地丁多酚黄酮提取工艺流程Fig.1 Flow chart of extracting polyphenol and flavonoids from Viola philippica

以紫花地丁干燥品为原料，称取一定量，加入不同量的60%乙醇，固定60℃，在一定的超声功率下，超声不同时间，提取3次，收集提取液。旋蒸除去乙醇，冷冻干燥机进行冻干备用[18-19]。

1.2.3 多酚及黄酮提取量的测定

1.2.3.1 多酚提取量的测定

精密称取紫花地丁冻干粉1 mg，加入10 mL蒸馏水使其充分溶解。按照1.2.1.1方法测定其多酚提取量，将测定的OD值带入标准曲线计算紫花地丁冻干粉中多酚提取量。

1.2.3.2 黄酮提取量的测定

精密称取紫花地丁冻干粉1 mg，加入10 mL蒸馏水使其充分溶解。按照1.2.1.2方法测定其黄酮提取量，将其测定的吸光度带入标准曲线计算紫花地丁冻干粉黄酮提取量。

1.2.4 单因素试验

1.2.4.1 料液比对多酚、黄酮提取量的影响

以固定功率270 W、乙醇浓度40%和温度60℃的条件下提取 10min，料液比依次为 1∶15、1∶20、1∶25、1∶35、1 ∶40（g/mL），平行提取 3 次，考察料液比对多酚、黄酮提取量的影响[20]。

1.2.4.2 超声温度对多酚、黄酮提取量的影响

以固定料液比1∶30（g/mL）、乙醇浓度40%和超声功率270 W 的条件下提取 10 min，在 20、40、60、80、100℃条件下平行提取3次，考察超声温度对多酚、黄酮提取量的影响。

1.2.4.3 超声时间对多酚、黄酮提取量的影响

以固定料液比 1∶30（g/mL）、超声功率 270 W、温度60℃和乙醇浓度40%的工艺，分别提取 0、3、5、10、15 min。平行提取3次，考察超声时间对多酚、黄酮提取量的影响。

1.2.4.4 超声功率对多酚、黄酮提取量的影响

以固定料液比1∶30（g/mL）、乙醇浓度40%、温度60 ℃的工艺，在超声功率 0、90、180、270、360 W 条件下提取10 min。平行提取3次，考察超声功率对多酚、黄酮提取量的影响。

以固定料液比 1∶30（g/mL）、超声功率 270 W、温度60℃的工艺，分别在乙醇浓度为10%、20%、40%、60%、80%条件下提取10 min，考察乙醇浓度对多酚、黄酮提取量的影响。

1.2.5 响应面试验设计

依据单因素试验工艺，为充分考量多酚、黄酮提取量的最佳提取条件，利用响应面分析法中的Box-Behnken模型进一步分析料液比、超声时间、超声功率3个因素，设计三因素三水平的试验方案如表1所示[21-22]。

表1 响应面分析因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 数据处理

利用Excel和SPSS 26.0软件进行数据统计分析及绘图，采用Design-Expert 10.0.0软件对Box-Behnken中心组合试验设计的试验数据进行回归分析，P<0.05表示具有显著性差异意义。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制结果

2.1.1 多酚标准曲线的绘制

随着课程改革的深入发展，人们对新课改理念理解表面化、肤浅化的现象越来越少，语文教学高位化和形式化的教学越来越没有市场，但应试式、结论化的问题依然非常严重，甚至有愈演愈烈之势。不少教师的备课就是抄教学参考书上的现成结论，上课就是直接或变着花样和形式，将现成的结论再传递给学生。学生的学习过程，就是上课被动接受现成结论，课后通过做各类题目强化结论的记忆。很显然，这和语文本色教学的主张是大相径庭的。本色语文并不局限于语文教语文，好的语文课应该什么都有而一切又为了语文。可教师们常问：这样的语文课，到底应该怎么上？

没食子酸的标准曲线回归方程为y=8.026 9x-0.001 7，y为吸光度；x为没食子酸质量分数（mg/g），R2=0.997 8，可得没食子酸浓度为0～0.2 mg/mL具有较好的线性关系，可应用于多酚提取量测定。

2.1.2 黄酮标准曲线的绘制

芦丁的标准曲线回归方程为y=1.110 8x+0.001，y为吸光度；x为黄酮质量分数（mg/g），R2=0.990 8，说明芦丁浓度为于0～0.2 mg/mL具有良好的线性关系，可应用于黄酮提取量测定。

2.2 不同提取条件对多酚黄酮提取量的影响

2.2.1 料液比对多酚、黄酮提取量的影响

料液比对多酚、黄酮提取量的影响见图2。

图2 料液比对多酚、黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction of polyphenol and flavonoids

由图 2可知，在料液比 1∶15（g/mL）～1∶40（g/mL）内，在增加溶剂的情况下，多酚、黄酮提取量均出现先上升后下降的趋势，其中料液比为1∶35（g/mL）时，多酚和黄酮的提取量均处于最高值，所以提取紫花地丁多酚、黄酮的最佳料液比为1∶35（g/mL）。

2.2.2 超声温度对多酚、黄酮提取量的影响

超声温度对多酚、黄酮提取量的影响见图3。

图3 超声温度对多酚、黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of polyphenol and flavonoids

由图3可知，在超声温度20℃～100℃时，随着超声温度的增加，多酚、黄酮提取量均呈现先上升后下降的趋势，而当60℃时，其提取量均达到最高值，所以最佳超声温度为60℃。

2.2.3 超声时间对多酚、黄酮提取量的影响

超声时间对多酚、黄酮提取量的影响见图4。

图4 超声时间对多酚、黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of ultrasound time on the extraction of polyphenol and flavonoids

由图4可知，在0～15 min时，随着超声时间的延长，多酚、黄酮提取量均呈增长趋势，但在5 min～15 min时，提取量相对较平缓，所以其最佳超声时间为5 min。

2.2.4 超声功率对多酚、黄酮提取量的影响

超声功率对多酚、黄酮提取量的影响见图5。

图5 超声功率对多酚、黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic extraction power on the extraction of polyphenol and flavonoids

由图5可知，在0～360 W时，多酚和黄酮提取量均呈先上升后下降的趋势。在270 W时，提取量达到最大值，由此确定最佳超声功率为270 W。

2.2.5 乙醇浓度对多酚、黄酮提取量的影响

乙醇浓度对多酚、黄酮提取量的影响见图6。

图6 乙醇浓度对多酚、黄酮提取量的影响Fig.6 Effect of ethanol on the extraction of polyphenol and flavonoids

由图6可知，在乙醇浓度为10%～80%时，多酚、黄酮提取量均出现先增长后下降趋势，在40%时达到最大值。由此确定最佳乙醇浓度为40%。

2.3 响应面法优化提取工艺结果

2.3.1 响应面设计结果与回归模型的建立

基于单因素试验的多酚、黄酮提取量，利用响应面分析法中的Box-Behnken模型进一步分析料液比、超声时间、超声功率3因素对多酚、黄酮提取量的影响情况，获得最优的提取工艺[15-16]。响应面设计结果以及方差分析见表2～表4。

表2 响应面法提取多酚黄酮提取量的结果Table 2 Results for response surface method to extract the content of polyphenol and flavonoids

表3 多酚提取工艺方差分析Table 3 Variance analysis of the extraction process of polyphenols

表4 黄酮提取工艺方差分析Table 4 Variance analysis of flavone extraction process

运用Design-Expert 10.0.0软件对提取的回归模型及方差分析结果进行拟合，得到相关的提取工艺回归公式：（1）多酚提取量=28.70+1.98A+2.70B+2.05C+3.84AB+0.56AC+0.36BC-4.85A2-12.14B2-6.37C2；（2）黄酮提取量=24.34+3.85A+3.29B+4.67C+2.41AB+3.91AC-0.77BC-3.64A2-11.72B2-2.69C2。

对公式（1）进行方差分析，回归方程的R2=0.983 2，说明模型拟合效果良好，此模型可以解释98.32%响应值的变化，可用于预测、分析紫花地丁中多酚的实际提取量。由表3可知，超声功率是多酚提取量的最主要的影响因素，且超声功率、超声时间、料液比对多酚提取量都具有显著性影响。

对公式（2）进行方差分析，回归方程的R2=0.984 7，说明模型拟合效果良好，此模型可以解释98.47%响应值的变化，可用于预测、分析紫花地丁中黄酮的实际提取量。由表4可知，超声时间是黄酮提取量的最主要的影响因素，且超声时间、超声功率、料液比均显著影响黄酮提取量。

2.3.2 交互因素对多酚、黄酮提取量响应面曲面图

运用Design-Expert 10.0.0统计与分析获得响应面曲面图。曲面弯曲明显说明该因素对多酚、黄酮提取量的影响显著，反之则表明该因素对多酚、黄酮提取量的影响不大。

2.3.2.1 多酚提取量曲面图

不同条件因素下多酚提取量情况见图7～图9。

图7 不同料液比、超声功率条件下多酚提取量响应面图Fig.7 Response surface diagram of polyphenol extraction under different liquid-solid ratio and ultrasonic power

图8 不同料液比、超声时间条件下多酚提取量响应面图Fig.8 Response surface diagram of polyphenol extraction under different liquid-solid ratio and ultrasonic time

图9 不同超声功率、超声时间条件下多酚提取量响应面图Fig.9 Response surface diagram of polyphenol extraction under different ultrasonic power and ultrasonic time

由图7可知，在60℃下提取8 min时，料液比和超声功率交互作用对多酚提取量的影响，在料液比不变时，随着超声功率的增大，多酚提取量呈现先升高再下降的趋势。而当超声功率不变时，随着溶液体积的增大，提取量也是呈现先递增后递减趋势。

由图8可知，在60℃、超声功率180 W时，超声时间和料液比交互作用对多酚提取量的影响，在超声时间不变时，随着溶液体积的增大，提取量出现先增大后递减的趋势。且在料液比不变时，超声时间的不断加大，提取量也是先增大后递减的趋势。

由图9可知，在60℃、料液比1∶15（g/mL）条件下，超声时间与超声功率交互作用对多酚提取量的影响。在超声时间不变的情况下，多酚提取量随着超声功率增大而先递增后递减，超声功率一定时，随着超声时间的延长，多酚提取量也是先增加后减少。

2.3.2.2 黄酮提取量曲面图

不同条件因素下黄酮提取量情况见图10～图12。

图10 不同料液比、超声功率条件下黄酮提取量响应面图Fig.10 Response surface diagram of flavonoid extraction under different liquid-solid ratio and ultrasonic power

图11 不同料液比、超声时间条件下黄酮提取量响应面图Fig.11 Response surface diagram of flavonoid extraction under different liquid-solid ratio and ultrasonic time

图12 不同超声功率、超声时间条件下黄酮提取量响应面图Fig.12 Response surface diagram of flavonoid extraction under different ultrasonic power and ultrasonic time

由图10可知，在60℃下提取8 min时，料液比和超声功率交互作用对黄酮提取量的影响，在料液比不变时，随着超声功率的增大，黄酮提取量呈现先递增后递减的趋势。而当超声功率不变时，随着溶液体积的增大，提取量也呈现先递增后递减趋势。

由图11可知，在60℃、超声功率180 W时，超声时间和料液比交互作用对黄酮提取量的影响，当超声时间不变时，随着溶液体积的增大，提取量呈先增加后减少趋势。同时当料液比不变时，随着超声时间的延长，提取量也出现先递增后递减趋势。

由图12可知，在60℃、料液比1∶15（g/mL）条件下，超声时间与超声功率交互作用对黄酮提取量的影响，在超声时间不变时，提取量随着超声功率增大而呈现先递增后递减趋势，当超声功率不变时，提取量也呈现先增加后减少趋势。

2.4 最佳提取工艺验证试验

通过响应面设计与优化，可得最佳的优化的参数。1）多酚提取优化方案为料液比1∶14.29（g/mL）、超声功率208.50 W、超声时间9.24 min，预测的多酚提取量为29.367 mg/g。2）黄酮提取优化方案为料液比1∶12.50（g/mL）、超声功率 214.32W、超声时间11.31min，预测的黄酮提取量为28.30 mg/g。实际验证操作中修正方案为1）多酚实际修正参数为料液比1∶14（g/mL）、超声功率210 W、超声时间9 min。2）黄酮实际修正参数为料液比1∶13（g/mL）、超声功率215 W、超声时间11 min。按修正后的工艺参数验证，进行3次平行提取试验，分别获得紫花地丁多酚提取量为29.04 mg/g，黄酮提取量为28.02 mg/g。修正工艺参数获得的多酚、黄酮提取量与预测提取量无明显差异，说明基于响应面法优化的提取工艺参数是可行的。

3 结论

基于响应面法通过超声辅助提取紫花地丁的多酚、黄酮提取量，在单因素参数条件的前提下运用响应面法进行多因素曲面试验设计，建立了紫花地丁多酚、黄酮的二次多项式回归模型。优化设计紫花地丁中多酚最佳提取工艺为超声时间9 min、超声功率210 W、料液比1∶14（g/mL）。黄酮最佳提取工艺为超声时间11 min、超声功率 215 W、料液比 1∶13（g/mL）。而通过该优化工艺参数可得多酚提取量达到预测值的98.98%，黄酮提取量达到预测值的99.01%。说明响应面法可用于优化紫花地丁多酚、黄酮提取量的提取方案，且试验经济简单，安全无毒，为深入研究紫花地丁中多酚、黄酮基础物质研究提供了理论依据。