miRNA-126及runt相关转录因子3在支气管哮喘患儿外周血中的表达及意义

王珺， 张广超， 陈丹， 孙晓敏

支气管哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病，可能伴有肺炎、呼吸衰竭等并发症[1]。目前，随着环境问题日益严峻，小儿支气管哮喘的发病率呈逐年上升趋势[2]。而支气管哮喘病因较为复杂，具体发病机制尚不完全清楚。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一种小于21个核苷酸的非编码RNA，具有高度的保守性，其通过调节相关靶基因表达，参与机体生长发育及多种疾病的发生发展过程[3]。miRNA-126是常见miRNAs之一，有研究显示，miRNA-126可能在支气管哮喘的发生发展中具有重要作用[4]。runt相关转录因子3(runt-related transcription factor 3，RUNX3)是一种重要的抑癌基因，近年来也显示与呼吸道疾病密切相关[5]，但其在支气管哮喘中的相关研究较少。我们利用生物信息学工具分析发现，miRNA-126和RUNX3之间存在靶向结合位点，且两者均被报道与呼吸道疾病有关[6-7]，但关于二者是否在哮喘中存在靶向关系尚无研究。因此，本研究拟通过检测支气管哮喘患儿外周血中miRNA-126及RUNX3的表达水平，探讨miRNA-126与RUNX3在小儿支气管哮喘中的作用及可能的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2020年3月至2021年6月在河南省儿童医院治疗的支气管哮喘患儿80例为研究对象，根据疾病临床情况分为急性期42例，缓解期38例。同期选取我院健康体检儿童40例为对照组。

1.2 诊断标准 参照《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》中相关支气管哮喘的诊断标准[8]。

1.3 纳入标准 (1)符合支气管哮喘的诊断标准；(2)年龄≤12岁；(3)本研究通过本院医学伦理委员会批准，患者家长均对本研究知情同意。

1.4 排除标准 (1)伴有心源性哮喘、气管内膜病变及变态反应性肺浸润等肺部疾病患儿；(2)近1个月内服用过糖皮质激素治疗；(3)近1周内服用过支气管扩张剂等抗哮喘药物；(4)患有全身性免疫系统疾病。

1.5 方法

1.5.1 一般资料 收集入院时患儿的性别、年龄、BMI、哮喘家族史、过敏病史、呼吸道反复感染史、父母吸烟史一般资料。

1.5.2 临床指标检测 (1)外周血miRNA-126检测：取新鲜抗凝静脉血2 mL，与生理盐水按1∶1混匀后，加入装有2 mL细胞分离液中，400g离心20 min，离心半径13.5 cm，离心后样品分2层，第2层为乳白色即为单核细胞层；收集该层细胞，加入生理盐水混匀，400g离心20 min，收集细胞沉淀即得所需外周血单核细胞；使用Trizol法提取外周血单核细胞总RNA；逆转录合成cDNA；使用RT-qPCR检测miRNA-126的mRNA表达水平，反应条件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40个循环。每个样本设置3个复孔，以U6为内参，采用2-△△CT法计算miRNA-126的mRNA的相对表达量。见表1。

表1 引物列表

(2)外周血单核细胞RUNX3蛋白水平检测：取新鲜抗凝血2 mL，同上方法收集外周血中的单核细胞，采用Western blot检测RUNX3蛋白表达水平。收集单核细胞后加入细胞裂解液，裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，离心半径10 cm，收集上清，采用二辛可宁酸蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取40 μg蛋白液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，用兔抗人RUNX3单克隆抗体(购自英国Abcam公司)，4 ℃孵育过夜，二抗室温避光孵育2 h，化学发光显色液进行显影，采用Image J软件分析条带灰度值，以β-actin为内参蛋白，计算各组RUNX3蛋白表达水平。

2 结果

2.1 一般及临床资料比较 见表2。与对照组比较，急性期组及缓解期组的性别、年龄、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05)，哮喘家族史、过敏史、呼吸道反复感染史均显著增加(P<0.05)，急性期组的父母吸烟史增加(P<0.05)；与缓解期组比较，急性期组的性别、年龄、BMI、哮喘家族史、过敏史、呼吸道反复感染史、父母吸烟史差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表2 研究对象一般及临床资料比较

2.2 miRNA-126与RUNX3表达水平比较 见图1。与对照组相比，缓解期组与急性期组miRNA-126 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，RUNX3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，且急性期组的miRNA-126 mRNA表达水平显著高于缓解期组(P<0.05)，RUNX3蛋白表达水平显著低于缓解期组(P<0.05)。

图1 不同组间的miRNA-126与RUNX3表达水平比较

2.3 miRNA-126与RUNX3水平的相关性分析 生物信息学数据库Starbase 3.0(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)分析结果显示，miRNA-126与RUNX3的3‘UTR端存在结合位点，提示二者之间可能存在靶向关系(图2)。

图2 Starbase预测的miRNA-126与RUNX3之间的靶向关系

Pearson相关性分析结果显示，哮喘儿童外周血中的miRNA-126与RUNX3水平呈显著负相关性(r=-0.232，P=0.039)，见图3。

图3 哮喘儿童外周血中miRNA-126与RUNX3表达水平的相关性

2.4 miRNA-126及RUNX3诊断哮喘及其临床分期的预测价值 ROC曲线结果显示，miRNA-126与RUNX3诊断哮喘的曲线下面积(AUC)分别为0.933，0.847，敏感性分别为87.50%，76.25%，特异性分别为92.50%，82.50%；miRNA-126与RUNX3诊断哮喘病情的AUC分别为0.696，0.798，敏感性分别为69.05%，92.86%，特异性分别为71.05%，63.16%，提示二者对儿童哮喘疾病具有一定诊断价值，见图4，表3。

表3 miRNA-126、RUNX3预测哮喘及其临床分期的ROC曲线分析

图4 miRNA-126、RUNX3预测哮喘及其临床分期的ROC曲线

3 讨论

支气管哮喘是呼吸科最常见的慢性呼吸道疾病之一，好发于儿童，并给其生活及正常生长发育带来较为严重的影响。加强对儿童支气管哮喘疾病诱发因素的关注对预防儿童哮喘具有重要作用。既往研究显示，过敏史、呼吸道反复感染史、父母哮喘史、父母吸烟史均是导致儿童支气管哮喘的独立危险因素[9]。本研究结果显示，与对照组相比，哮喘患儿的哮喘家族史、过敏史、呼吸道反复感染史、父母吸烟史比例均显著升高，与既往研究一致。研究显示，miRNA作为一类非编码RNA，可与多种靶基因结合，通过调控靶基因的表达，进而参与多种疾病的发生发展，如肿瘤[10]、哮喘等[11]。miRNA-126是miRNAs家族中的重要一员，既往研究表明miRNA-126异常表达与哮喘的发生发展密切相关[12]。邢国英等[13]通过抑制哮喘小鼠肺组织miRNA-126表达，可显著降低Th2型细胞炎性细胞因子水平表达，缓解哮喘小鼠气道炎症反应和气道高反应，进一步说明miRNA-126可能通过调节Th2型细胞参与哮喘发生。研究显示哮喘患者中的miRNA-126水平明显增加，且急性期更为显著，对哮喘诊断具有一定的预测价值[14]。

RUNX3属于Runt家族，作为重要的免疫系统调节因子，具有转录调控功能，可调节特异性基因的表达，与各种人类疾病的发生和发展密切相关，如胃癌[15]、结肠癌[16]等疾病。有研究显示，RUNX3基因敲除小鼠可出现嗜酸性粒细胞增多，导致肺部炎症反应和气道重塑现象[17]。研究已显示支气管哮喘患者中RUNX3基因表达水平显著降低，且急性期低于缓解期[18]。RUNX3还可通过调控基因表达对T细胞、B细胞发挥免疫调节作用。另外，研究显示miRNAs中某些成员对RUNX3具有靶向调控功能，如miRNA-138可通过靶向调控RUNX3基因表达参与银屑病的发生发展[19]。miRNA-371，miRNA-138，miRNA-544，miRNA-145可通过靶向调控RUNX3mRNA表达水平参与哮喘的发生发展[20]。本研究结果显示，支气管哮喘患儿外周血单核细胞中的miRNA-126表达水平升高，RUNX3蛋白表达水平降低，而急性期组的miRNA-126显著高于缓解期组，RUNX3蛋白表达水平显著低于缓解期组，且miRNA-126与RUNX3在诊断哮喘以及评估其病情的严重程度均具有一定的诊断价值。以上结果提示外周血单核细胞中的miRNA-126与RUNX3均与支气管哮喘患儿的发生发展密切相关，可能作为判断支气管哮喘疾病的预测指标。另外研究表明,miRNA-138与RUNX3呈负相关，miRNA-138可通过靶向RUNX3基因调节Th1/Th2平衡参与哮喘的发生发展[21]。本研究结果显示，miRNA-126与RUNX3可能具有靶向关系，且相关性分析显示，miRNA-126与RUNX3呈显著负相关性。以上结果说明外周血单核细胞中miRNA-126可能是通过靶向RUNX3基因的表达,进而参与支气管哮喘疾病发生、发展。

综上所述，本研究认为支气管哮喘患儿外周血单核细胞中存在miRNA-126高表达、RUNX3蛋白低表达，且二者间可能存在靶向协同作用，共同参与支气管哮喘疾病发生、发展。