赤峰地区苦菜中叶绿素提取工艺的研究

于晓伟

(赤峰学院化学与生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000)

苦菜(Sonchus Oleraceus L)，属于菊科植物[1]，具有很高的营养价值，含有丰富的蛋白质、糖、食物纤维、钙、铁、锰等矿物元素。目前关于苦菜的研究主要集中在苦菜的成分分析、分类鉴定、生物活性作用等方面[2-5]，但是，目前关于苦菜中叶绿素提取的研究却鲜有报道。在植物生长发育过程中，叶绿素起着非常重要的作用，也是植物进行光合作用的主要色素之一[6,7]。目前，关于叶绿素提取方法的研究报道很多，何思宇[8]等通过溶液浸提法对菠菜中的叶绿素提取工艺进行了优化，叶绿素提取含量可以达到1.89mg·g-1，并进行了酪蛋白分散体系的研究，取得了一定的效果；王凤婷等[9]以小白菜、菠菜和生菜为试验材料，研究了改进的研磨法在叶绿素提取试验中的应用，研究结果表明，该方法用时短、重复性好、操作简单，同时可以应用于不同植物；盛璐等[10]研究不同处理提取液对铁线莲“亲爱的”叶绿素含量测定的影响，结果表明，不同提取剂配比对叶绿素含量的提取及稳定性的影响有着明显的差异；甘勇辉[11]等研究了不同提取液提取金线莲中叶片叶绿素效果，结果表明，金线莲叶绿素含量测定提取液为丙酮-乙醇混合液或80%丙酮时提取效果最好；刘颖等[12]研究了超声波辅助混合溶剂提取黄花菜叶绿素的最佳条件，研究结果表明，使用超声波辅助混合溶剂方法后叶绿素的提取含量明显升高，反应时间更短。本试验采用超声波辅助不同溶剂法对赤峰地区苦菜中叶绿素的提取进行研究，通过浸提效果确定最佳工艺条件。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

试材为新鲜苦菜叶，采摘于内蒙古赤峰市松山区当铺地满族乡，叶片要求完整，颜色鲜艳，消掉泥土，沥干水分后，置于40℃干燥箱中烘干，研磨，通过100目筛子筛选后备用。

1.2 试剂与仪器

无水乙醇，分析纯(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；丙酮，分析纯(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；试验用水均为去离子水，采购获得。

1.2.2 仪器

电子天平(Secura612-1CN，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产)；高速离心机(DD-5M，湖南沪康离心机有限公司生产)；数显恒温水浴锅(HHS，江苏省金坛市金祥龙电子有限公司生产)；紫外可见分光光度计(TU-1810，PC型，北京普析通用生产)；超声波清洗机(SB-5200DTN，宁波新芝生物科技股份有限公司生产)。

1.3 试验方法

1.3.1 苦菜中叶绿素的提取与测定

用电子天平准确称量苦菜样品(0.5g)于具塞试管中，加入一定量体积的乙醇或丙酮试剂，具塞试管用锡纸包裹避免光线照射，在一定提取温度和一定时间的超声波(超声功率250W)处理下，待温度降低到室温后，用高速离心机离心处理5min(2500r·min-1，20℃)，取一定量的离心溶液，放入石英试管中，以乙醇溶剂作为空白对照，利用紫外分光光度计测定波长为645nm和663nm下的吸光值并记录。根据Arnon公式[13]，算出叶绿素a、叶绿素b和叶绿素的总含量。Arnon公式具体如下。

叶绿素a含量Ca(mg·g-1)：

当时，环形珠垫的编织方法是基于的周期运动，采用数学表达式的形式表示其周期运动的规律，下行线的运动表示为，上行线的运动表示为，即

Ca=[(12.71×OD663-2.59×OD645)×V]/1000×W

叶绿素b含量Cb(mg·g-1):

Cb=[(22.9OD645-4.67×OD663)×V]/1000×W

叶绿素提取量C(a+b)(mg·g-1):

C(a+b)=Ca+Cb

式中，OD645表示波长为645nm下的吸光度值；OD663表示波长为663nm下的吸光度值；V表示提取液的体积，mL；W表示苦菜质量，g。

1.3.2 单因素分析实验

分别以乙醇和丙酮为提取剂，设计不同的液料比(mL·g-1)，提取时间、提取温度和超声波超声时间为单因素变量，测量苦菜中叶绿素的含量。具体设计：当液料比为30∶1，提取时间为20min，超声波(超声功率250W)10min时，改变提取温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；当提取温度为50℃，液料比为30∶1，超声波(超声功率250W)10min时，改变提取时间分别为10min、20min、30min、40min、50min；当提取温度为50℃，提取时间为20min，超声波(超声功率250W)10min时，改变液料比分别为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1；当提取温度为50℃，液料比为30∶1，提取时间为20min，改变超声波(超声功率250W)，时间分别为10min、20min、30min、40min。比较提取温度、提取时间、液料比和超声时间对苦菜中叶绿素提取含量的影响。

1.3.3 Box-Behnken试验设计

在单因素分析试验结果的基础上，以提取温度(A)、提取时间(B)、液料比(C)、超声时间(D)为自变量，苦菜中叶绿素提取量(Y)为响应值，采用Box-Behnken设计法对苦菜中叶绿素的提取工艺条件进行优化。响应面试验设计及因素水平见表1。

1.3.4 数据处理

使用Excel和Design Expert 11软件进行数据统计分析，建立方程模型和作图。每次试验处理均重复3次，取其平均值。

表1 响应面试验设计及因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度对苦菜中叶绿素提取含量的影响

图1 提取温度对叶绿素提取含量的影响

由图1可知，当分别以乙醇和丙酮作为提取剂时，在液料比为30∶1，提取时间为20min，超声波(超声功率250W)10min时，分别改变不同提取温度，随着温度的不断升高，叶绿素的提取含量不断增大，当反应温度达到50℃时，两者的叶绿素提取量均达到的最大值，此时继续提高反应温度，叶绿素的提取含量明显下降。相对于以乙醇作为提取剂，丙酮作为提取剂时的叶绿素提取含量在各个温度下均低于乙醇，乙醇的提取效果更好。

2.1.2 提取时间对苦菜中叶绿素提取含量的影响

图2 提取时间对叶绿素提取含量的影响

由图2可知，分别以乙醇和丙酮作为提取剂时，当提取温度为50℃，液料比为30∶1，超声波(超声功率250W)10min时，改变提取时间，发现随着提取时间的不断延长，以乙醇为提取剂的叶绿素的提取量在20～40min的过程中出现一个陡增的过程，叶绿素含量明显提高，当提取时间超过40min时，提取量有下降的趋势；以丙酮为提取剂的叶绿素的整体提取量变化不明显，提取含量明显少于以乙醇作为提取剂，提取效果不明显。

2.1.3 液料比对苦菜中叶绿素提取含量的影响

图3 液料比对叶绿素提取含量的影响

由图3可知，分别以乙醇和丙酮作为提取剂时，当提取温度为50℃，提取时间为20min，超声波(超声功率250W)10min时，在不同液料比的条件下，以乙醇作为提取剂的叶绿素的含量在液料比为30∶1时，达到最大值，继续增大液料比对叶绿素提取量的影响不大；以丙酮作为提取剂的叶绿素的含量同样在30∶1时，达到峰值，继续增大液料比对叶绿素提取量的影响不大。且当液料比大于40∶1时，以丙酮作为提取剂的叶绿素的提取量要好于以乙醇作为提取剂的提取效果。

2.1.4 超声时间对苦菜中叶绿素提取含量的影响

图4 超声时间对叶绿素提取含量的影响

由图4可知，分别以乙醇和丙酮作为提取剂时，当提取温度为50℃，液料比为30∶1，提取时间为20min，改变超声波(超声功率250W)的时间。当以乙醇作为提取剂时，当超声(超声功率250W)时间为20min时，叶绿素的提取含量达到最大值，继续延长超声时间对叶绿的提取量的影响不大；当以丙酮作为提取剂时，当超声(超声功率250W)时间为20min时，叶绿素的提取含量达到最大值，随着时间的延长，叶绿素的提取量有一定的降低。以乙醇作为提取剂的叶绿素的提取量的最大值要高于以丙酮作为提取剂的叶绿素提取量。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 试验方案设计及结果

利用Design Expert 11 软件里的Box-Behnken设计试验方案，其响应值及方差分析结果见表2。对表2数据进行分析，得到叶绿素提取量(Y)和编码自变量A、B、C、D的回归方程：Y=0.7280+0.0042A+0.0525B+0.0183C+0.0133D-0.06AB+0.005AC-0.0125AD-0.005BC-0.0025BD-0.05CD+0.0477A2-0.1377B2-0.0415C2-0.34D2。

由响应面方差分析表可知，见表3，该方程模型极显著(p<0.05)，说明所得方程拟合较好，回归显著。方程程模型的校正相关系数R2=0.8006，校正绝对系数R2Adj=0.613，说明试验因素A、B、C、D对叶绿素提取量影响显著。其中，B2的P值<0.0001，说明对叶绿素提取量影响极显著。根据回归方程中各项系数的绝对值表示各因素对响应值影响的大小、正负表示对响应值影响的方向的原理[14]，得到影响苦菜中叶绿素提取率的因素大小依次为提取时间(B)>液料比(C)>超声时间(D)>反应温度(A)，其中提取时间对叶绿素提取量的影响可达极显著水平。

2.2.2 验证试验

响应面优化得苦菜中叶绿素提取工艺最佳条件为提取反应温度为40℃，提取反应时间为40min，液料比为30∶1，超声波(超声功率250W)的时间为20min。通过优化后的参数做3组平行试验，最终测得苦菜中叶绿素的提取量为0.81±0.03mg·g-1，证明该方程可靠、有效，可用于模拟苦菜中叶绿素的提取工艺。

3 结论

本文通过比较以乙醇和丙酮作为提取剂，研究了提取温度、提取时间、液料比和超声波(超声功率250W)时间等因素对苦菜中叶绿素提取含量的影响，并通过响应面法优化了苦菜中叶绿素的条件。最后得出结论：以乙醇作为提取剂提取叶绿素的效果明显好于以丙酮作为提取剂；最佳反应工艺条件为提取温度为40℃，提取时间为40min，液料比为30∶1，超声波(超声功率250W)时间为20min。此结果为今后在苦菜中叶绿素提取提供了可行的参考方法。