人工种植和野生杜仲叶中主要活性成分含量变化研究

章发盛 黄继红 黄静

(湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南 吉首 416000)

杜仲为古老的第三纪孑遗植物，其野生种群被列为国家二级保护植物，是多年生落叶乔木，树高可达20m以上[1]。但是，乔木自然栽培模式，对于采摘杜仲鲜叶十分困难，所以，当前大多采用果园化栽培方法进行人工种植，以适应杜仲产业高质量发展需求。2005年，我国将杜仲叶正式列入《中华人民共和国药典》(一部)，为杜仲科植物杜仲的干燥叶。夏、秋两季枝叶茂盛时采收，晒干或低温烘干，具有补肝肾、强筋骨功能[2]，并确定绿原酸为杜仲叶药材的主要药用有效成分及其含量标准。

湖南是中国杜仲的重要原产地和传统栽培模式的主产区之一，占全国总数的1/5，湘西武陵山区的杜仲占全省的80%，是湖南杜仲的集中聚集区[3]，近年来湘西龙头企业从外地引进了杜仲优良品种，采用果园化栽培模式开展杜仲良种示范园建设，促进杜仲产业发展，助推湘西乡村振兴。本实验采收不同月份湘西山区3家人工种植基地和3处野生杜仲林中鲜叶为样品，低温烘干后粉碎，采用高效液相色谱法对杜仲叶中主要活性成分绿原酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、车叶草苷、异槲皮素和芦丁进行测定。研究人工种植和野生杜仲叶不同生长期6种活性成分积累的变化规律，为湘西武陵山区杜仲叶的合理采收期提供科学依据。

1 试验方法

1.1 基地基本情况

1.1.1 野生杜仲基地(树龄约35a)

张家界永定区科三湾；吉首市马颈坳镇良章营；花垣县金龙镇补毫村。

1.1.2 人工种植基地(外地引种，树龄约10a)

永顺县芙蓉镇孔坪村(“华仲1号”)；泸溪县潭溪镇新寨坪(“华仲8号”)；保靖县迁陵镇土碧村(“秦仲5号”)。

1.2 杜仲叶的采收和处理

从2021年4月开始搜寻人工种植和野生杜仲栽培基地，确定为研究基地后，间隔1个月依次采收(由于疫情等条件限制，个别基地有少量缺失)，一直到11月落叶前。对采集的鲜叶晒干，60℃低温烘干，粉碎过筛后，常温干燥保存。

1.3 人工种植和野生杜仲叶中6种活性成分含量的测定方法

1.3.1 含水率的测定方法

采用直接干燥法[4]测定低温烘干后的杜仲叶样品的含水率，以干燥品计算6种活性成分含量。

1.3.2 活性成分的提取条件和测定方法

准确称取0.5g杜仲叶样品，用70%乙醇浸提过夜，超声提取3次，合并滤液，用70%乙醇定容待检。

采用日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪(配置二极管阵列检测器)同时测定6种活性成分含量。标准品相关信息见表1。

2 结果与分析

2.1 人工种植和野生杜仲叶中绿原酸含量的比较分析

不同月份采集的人工种植和野生杜仲叶中绿原酸含量的测定结果如表2所示。

表1 标准品及其规格与生产厂商

表2 不同月份杜仲叶中绿原酸的含量

由表2可知，4月杜仲始发嫩芽，到11月落叶前，绿原酸含量2.541～52.554mg·g-1，按照《中华人民共和国药典》2020(一部)，绿原酸含量不得少于0.080%标准[2]，分别是《药典》规定的3.17～65.69倍。16批次野生杜仲叶绿原酸平均含量21.72mg·g-1，19批次人工种植杜仲叶绿原酸平均含量32.93mg·g-1，人工种植为野生杜仲叶的1.5倍。从图1分析，5月开始枝叶茂盛，绿原酸含量28.469～36.27mg·g-1，可以进入采收期，并且含量随着生长时间的增长逐渐增加。8月绿原酸含量降低，9月上升，10月再次降低，11月再次上升，呈现出W型形态。由绿原酸含量分析，8月、9月和11月为提取绿原酸添加剂产业的鲜叶最佳采收期。

2.2 人工种植和野生杜仲叶中桃叶珊瑚苷含量的比较分析

不同月份采收的人工种植和野生杜仲叶中桃叶珊瑚苷含量的测定结果如表3所示。

表3 不同月份杜仲叶中桃叶珊瑚苷的含量

由表3可知，16批次野生杜仲叶桃叶珊瑚苷平均含量11.16mg·g-1，19批次人工种植杜仲叶桃叶珊瑚苷平均含量12.37mg·g-1，人工种植和野生杜仲叶的桃叶珊瑚苷含量差异很小。然而，由图2分析，同一基地桃叶珊瑚苷随着生长时间的增长起伏很大。4月和6月张家界科三湾野生杜仲叶以及6月保靖土碧村人工种植基地桃叶珊瑚苷积累很少，均没有检出。从时间跨度分析，桃叶珊瑚苷含量呈骆驼双峰变化趋势，7月为第1个高峰13.55mg·g-1，除吉首良章营野生杜仲外，均超过10mg·g-1，9月为第2个高峰值，桃叶珊瑚苷平均含量33.746mg·g-1，最高值达到55.659mg·g-1，进入提取桃叶珊瑚苷活性物质的最佳采收期。

2.3 人工种植和野生杜仲叶中京尼平苷酸含量的比较分析

不同月份采收的人工种植和野生杜仲叶中京尼平苷酸含量的测定结果如表4所示。

图1 不同月份人工种植和野生杜仲叶中绿原酸含量趋势图 图2 不同月份人工种植和野生杜仲叶中桃叶珊瑚苷含量趋势图

表4 不同月份杜仲叶中京尼平苷酸的含量

由表4可知，16批次野生杜仲叶京尼平苷酸平均含量7.15mg·g-1，19批次人工种植杜仲叶京尼平苷酸平均含量7.95mg·g-1，人工种植和野生杜仲叶的京尼平苷酸含量差异不大。但是，由图3分析，同一基地京尼平苷酸随着生长时间的增长，9月为达到最高平均值21.09mg·g-1(张家界科三湾野杜仲除外)，最高值达到30.947mg·g-1。张家界科三湾野杜仲叶，4月和6月京尼平苷酸含量均未检出，9月京尼平苷酸含量0.338mg·g-1，10月含量6.566mg·g-1，最高值比其他5个基地推迟了1个月份，可能与张家界杜仲品种以及生长海拨较高相关。

2.4 人工种植和野生杜仲叶中车叶草苷含量的比较分析

不同月份采收的人工种植和野生杜仲叶中车叶草苷含量的测定结果如表5所示。

由表5可知，16批次野生杜仲叶车叶草苷平均含量5.58mg·g-1，19批次人工种植杜仲叶车叶草苷平均含量7.79mg·g-1，人工种植为野生杜仲叶的车叶草苷含量1.4倍。从图4分析，车叶草苷的含量随着生长时间的增长逐渐增加。4月采收的嫩叶中车叶草苷含量很少，3处基地样品中均未检出。5月开始稳步增长，车叶草苷平均含量5.06mg·g-1，6月平均含量3.365mg·g-1(除张家界科三湾外)，7月平均含量6.918mg·g-1，8月平均含量降低至5.187mg·g-1，9月上升至平均含量16.00mg·g-1(除张家界科三湾外)，达到全年最高值，10月再次下降至5.53mg·g-1，11月再次上升到10.85mg·g-1，整体趋势呈现出W型形态。

2.5 人工种植和野生杜仲叶中异槲皮素含量的比较分析

不同月份采收的人工种植和野生杜仲叶中异槲皮素含量的测定结果如表6所示。

图3 不同月份人工种植和野生杜仲叶中京尼平苷酸含量趋势图 图4 不同月份人工种植和野生杜仲叶中车叶草苷含量趋势图

表6 不同月份杜仲叶中异槲皮素的含量

由表6可知，16批次野生杜仲叶异槲皮素平均含量1.51mg·g-1，19批次人工种植杜仲叶异槲皮素平均含量4.20mg·g-1，人工种植是野生杜仲叶的异槲皮素含量2.8倍。从图5分析，异槲皮素的含量随着生长时间稳定增长，异槲皮素的含量范围0.108～9.829mg·g-1，11月异槲皮素的平均含量达到最高值5.76mg·g-1。

2.6 人工种植和野生杜仲叶中芦丁含量的比较分析

不同月份采收的人工种植和野生杜仲叶中芦丁含量的测定结果如表7所示。

表7 不同月份杜仲叶中芦丁的含量

图5 不同月份人工种植和野生杜仲叶中异槲皮素含量趋势图 图6 不同月份人工种植和野生杜仲叶中芦丁含量趋势图

由表7可知，16批次野生杜仲叶芦丁平均含量0.61mg·g-1，19批次人工种植杜仲叶芦丁平均含量2.05mg·g-1，人工种植是野生杜仲叶的芦丁含量3.4倍。从图6分析，芦丁的含量随着生长时间的稳定增长，芦丁的含量范围0.138～3.444mg·g-1。

3 结论

人工种植和野生杜仲叶中绿原酸含量为2.541～52.554mg·g-1，分别为《中华人民共和国药典》(一部)标准值0.08%的3.17～65.69倍，远超规定要求。

人工种植杜仲叶中绿原酸、车叶草苷、异槲皮素、芦丁的平均含量分别为32.93mg·g-1、7.79mg·g-1、4.20mg·g-1、2.05mg·g-1，分别是野生杜仲叶的1.5倍、1.4倍、2.8倍、3.4倍。人工种植和野生杜仲叶中桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸平均含量差异比较小。说明人工种植和野生杜仲叶中活性成分密切相关，引进优良品种，采用果园化栽培方法人工种植，方便采集杜仲原料，使多数活性成分含量得到提升，具有推广应用价值，有利于杜仲产业高质量发展。

从杜仲生长周期分析，杜仲叶中绿原酸和车叶草苷含量呈W形趋势变化，8月、9月、11月为鲜叶最佳采收期。桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸含量为骆驼双峰形态，7月、9月为鲜叶最佳采收期。异槲皮素和芦丁含量比较稳定，可以作为主要活性成分的参考。