引种黑木耳菌株菌丝体基础生物学特性研究

和耀威 黄静 向准 熊雪 李鹏 杨彝华

(贵州省生物研究所，贵州 贵阳 550009)

黑木耳(Auricularia heimuer)是国内外最常食用的真菌之一，在食用菌中具有极高的地位，也是中国实现人工栽培最早的食用菌[1]，栽培方式有段木栽培和代料栽培，口感良好，味道鲜美，其所含的多糖作为重要的活性成分，能够降低血脂和血糖、增强人体免疫力及起到抗氧化的作用[2-4]，是生活中健康营养物质的良好来源，也是食、药两用的珍稀食用菌[5]；因其适宜生长范围广泛，国内外都具有良好的市场潜力；其在国内脱贫攻坚中起了良好的作用，目前处于脱贫攻坚与乡村振兴有效衔接的阶段，黑木耳也定能发挥重要的作用。对于引进的菌株，在不同的环境下其生长所需的条件会有所不同，因此本文通过对其生物学特性的研究，及时掌握其最适生长条件，旨在为其走向市场并大范围推广奠定基础，降低示范推广风险。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

供试黑木耳菌株来源见表1。

1.1.2 PDA培养基

上海博微生物科技有限公司生产的250g规格产品。

1.1.3 固体基础培养基

20g琼脂，20g葡萄糖，2g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，0.5g七水硫酸镁，10mg维生素B1，去离子水1000mL。

1.1.4 液体基础培养基

1g磷酸二氢钾，0.5g七水硫酸镁，10mg维生素B1，去离子水1000mL。

表1 黑木耳供试品种

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

制备12个PDA培养基，按照超净工作台试验规程将母种从试管转接到备用平板PDA培养基中心位置，供试菌株分别转接3个平板，接种后放置于25℃恒温培养箱暗培养7～10d备用。

1.2.2 拮抗试验

将4个菌株每2个为1组进行拮抗试验，设置3个重复。在超净工作台采用5mm的打孔器将菌落打成圆片或用接种刀切成大小一致的菌块，按照“：”形在平板上进行接种，两两间距保持相等，约为3cm。放置在25℃恒温培养箱暗培养7d，观察两两之间的拮抗情况。

1.2.3 温度试验

选取菌丝长势均匀且长满的活化平板，用5mm的打孔器在菌落边缘位置依次打为圆片，将圆片转接于PDA培养基上并进行菌株号等信息标注，将转接平板分别放置在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃的恒温培养箱内暗培养，供试菌株不同温度设5个重复梯度，以2d1次对菌丝生长情况进行观察和记录。

1.2.4 pH试验

在PDA培养基中加入配好的0.1moL·L-1HCL和0.1moL·L-1NaOH，分别调整pH，分别设置设pH为3、4、5、6、7、8、9、10 8个梯度，每个梯度5次重复，按1.2.3温度试验的选取和接种方法，将转接平板放置在25℃恒温培养箱内暗培养，每1个pH梯度设5次重复，每2d对菌丝生长情况进行观察和记录。最终综合菌落直径和菌丝浓密情况确定最适pH。

1.2.5 碳源筛选试验

以固体基础培养基培养作为对照(CK)；试验组，基本培养基中的葡萄糖分别被等量的可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麦麸浸提液、麦芽糖和木屑浸提液取代，作为不同碳源的培养基。每个处理接种3个重复平板。用5mm的打孔器将菌丝长满的活化平板在平板边缘处打成圆盘状，然后将其接种在平板中心。在25℃下暗培养，每24h观察1次菌丝的生长情况，从菌丝发芽开始，记录菌丝的发芽时间，用“十字”法测量菌丝的生长速度。菌丝体的日平均生长速度则以萌发后菌落的日平均直径增长来计算。当菌丝体覆盖满平板时，观察和记录平板内菌落形态特征、颜色情况、菌丝生长速度和尖端特征等。“+”和“-”用来表示菌丝的生长情况。“+”越多，说明菌丝体生长得越好、越强、越均匀；“-”则表示菌丝无生长情况。

1.2.6 氮源筛选试验

对照组(CK)在固体基本培养基中培养，在基本培养基中分别用等量的玉米浆、豆粕粉、酵母粉、尿素、蛋白胨(浓度为3.0g·L-1)代替CK内的硫酸铵。每个氮源培养基设置3次重复。用5mm的打孔器将菌丝长满的活化平板在平板边缘处打成圆盘状，然后将其接种在平板中心。在25℃下观察菌丝生长情况。后续程序为1.2.5。

1.2.7 最佳碳氮源浓度组合试验

选定适宜碳源木屑浸提液(碳源1)、麦麸浸提液(碳源2)，氮源玉米浆(氮源1)、豆粕粉(氮源2)，采用L9(34)正交表进行4因素3水平正交试验，以不含碳源、氮源的液体基础培养基为基础，通过不同组合形成供试培养基，见表2。分别以因素(碳源1和2及氮源1和2)开展试验，各因素以含量为梯度设计3个水平，形成9个试验组，每试验组设3重复，接种于250mL锥形瓶，每瓶接种4个直径5mm的菌块，置30℃、150rpm的摇床中进行培养，连续培养8d，每日观察菌丝长势、浓密程度、均匀程度、是否污染，最终测定菌丝生物量。

表2 正交试验因素水平表

1.3 统计学分析

以上所得数据使用SPSS 18.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗试验结果

拮抗试验可以直观地显示各菌株种群之间的亲缘关系，当亲缘关系较远、完全独立的杂合或基因型不同的菌株时，各菌株种群之间会发生非亲和反应，表现出拮抗现象；相反，亲缘关系较近或基因型相同的菌株之间则不会表现出拮抗现象。由4个黑木耳菌株的拮抗试验可以看出，见表3，H5和H10之间没有表现出拮抗现象，H15和H24之间也无拮抗现象，说明H5和H10亲缘关系近，H15和H24之间亲缘关系也近，而H5和H15、H24之间有拮抗现象，H10和H15、H24之间也有拮抗现象，说明H5和H10为一类群，H15和H24为另一类群。

表3 拮抗试验结果

2.2 温度试验结果

从图1可看出，供试菌株的菌丝在4℃暗培养时菌丝受抑制不生长，当温度为10～35℃温度梯度内则菌丝生长不受抑制，在10～30℃速度和温度呈正相关；H10、H15和H24在30℃时菌丝长速最快，之后长速有所下降，而H5则到35℃时才达到最快，但H5菌丝长速在30℃与35℃间差异极小；综合以上情况可以看出，供试菌株适宜温度在30～35℃。

图1 不同温度对供试菌株菌丝长速的影响

2.3 pH试验结果

从图2可以看出，H10和H15 2个菌株的菌丝在pH 3～10的范围内都可以生长，而H5和H24则不能在pH 3上生长，其余梯度可以生长，说明H10和H15 2个菌株的酸碱度适应范围比H5和H24更大。H15在pH 3时菌丝长速最快，其余菌株菌丝在pH 6的碱性条件下日均长速最快，而且除H15外，其余菌株表现出的长速变化趋势基本一致，表明H15菌株更能适应酸性条件。从整体酸碱条件看，在pH4～6内的菌丝生长速度明显高于pH7～10的区间，说明4个黑木耳菌株更适宜在偏酸环境下生长；pH适宜范围在5～6。

图2 不同pH对供试菌株菌丝生长的影响

2.4 碳源筛选试验结果

通过试验发现，4个菌株在不同碳源处理中都能正常生长，且在生长速度和菌丝长势上不同碳源间存在显著差异(p<0.05)，4个菌株在不同碳源下的变化基本一致，菌丝长速和菌丝长势上都是麦麸浸提液、木屑浸提液和可溶性淀粉三者依次排前3，乳糖和麦芽糖效果垫底。说明麦麸浸提液和木屑浸提液更适合作为菌丝培养的碳源，乳糖和麦芽糖则不适宜。

表4 不同碳源对供试菌株生长的影响

由表5可以看出，各菌株在6种不同氮源处理中都能生长，且在菌丝长速和长势上达到显著差异(p<0.05)；但是硫酸铵和尿素作为氮源时菌丝长速和长势都表现最差，与其他4种差异大，菌丝长速很慢，长势差，表明其不适合作为菌丝培养时氮源添加物；豆粕粉和玉米浆在长速和长势上排名前2，适合作为菌丝培养时氮源添加物。

表5 不同氮源对供试菌株生长的影响

2.5 最佳碳氮源浓度组合试验结果

由表6可以看出，4个供试菌株在2个碳源和2个氮源的不同正交组合下均能正常生长，且所有菌株在组合3下生物量最高，分别为5号菌株2.91g，10号菌株2.77g，15号菌株2.84g，24号菌株2.89g；与其他组合均达到显著差异(p<0.05)，组合1和组合6生物量显著低于其他组合。通过对不同组合下4个菌株平均生物量的统计得出图3，从图3可以看出，不同组合间生物量达到显著差异(p<0.05)，不同组合生物量由高到低为3>7>5>4>8>1>2>9>6，说明组合3最适合供试菌株生长，其次为组合7和组合5等。

表6 不同碳氮源组合对供试菌株生长的影响

图3 不同组合下供试菌株生物量(干重)

3 讨论与结论

在食用菌栽培中，对菌种基础生物学特性研究已经有很久的历史，也是食用菌高质量发展中最基础最重要的环节之一。本文中各供试菌株虽然通过拮抗实验被分为2个类群，但是在菌丝生长最适温度和最适pH范围上高度相近，这可能与供试菌种来自相同省份，可能存在较为相近的遗传关系有关，具体遗传关系需要后续进一步确定；赵梓楠[6]开展的“998”等5个黑木耳菌种生物学特性的研究得出，供试菌种最适温度在25℃左右；李发盛等[7]开展的“云耳百云6号”的生物学特性试验发现，“云耳百云6号”最适温度为25～30℃，pH范围为5.5～6.5，黄豆粉为最佳氮源；郭砚翠等[8]开展的“黑木耳8808”菌株生物学特性研究发现，“黑木耳8808”菌株的最适温度为25～30℃；王灿琴等[9]通过对5个野生云耳菌株生物学特性的研究发现，供试菌株最适温度为30℃，最适酸碱度为pH8～9，最佳氮、碳源分别为酵母膏和葡萄糖；前人相关研究在温度上与本研究结果有所差异，但差异不大，最适pH与李发盛等研究结果一致，和王灿琴等研究有所差异，但是具有共性，即供试菌株在最适pH范围上存在一致性，这也许与来自同一地方的菌株在某些因子上具有相近的适应性有关，最佳碳源和氮源分别为麦麸浸提液和豆粕粉，和王灿琴等的研究结果不一致，但是两者都发现蔗糖和乳糖不适合作为碳源添加物，硫酸铵不适合作为氮源添加物，在氮源上与李发盛等研究结果一致。在最佳碳氮源筛选中，郭砚翠等开展的“黑木耳8808”菌株碳氮源筛选发现在硬杂木屑、麦麸和豆粉组合中菌丝生长速度最快，菌丝黑密，和本研究结果具有一致性。

通过对4个引进的黑木耳菌种进行拮抗和基础生物学特性研究发现，供试菌株分为2个类群，H5和H10为一类群，H15和H24为另一类群，两类群虽然在遗传关系上有差异，但是在最适温度，最适pH，最佳碳氮源和最佳碳氮源组合上都具有一致性，最适温度在30～35℃，最适pH为5～6，最佳碳源和氮源为麦麸浸提液和玉米浆，最佳液体基础培养基为木屑浸提液23g，麦麸浸提液10g，玉米浆1g，豆粕粉5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，维生素B10.1g，去离子水1000mL。