铜绿假单胞菌与秀丽隐杆线虫互作研究进展

邹伟，赵歆，张新乐，王琦

（昆明医科大学 公共卫生学院，云南昆明 650500）

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）因具有生长周期短、便于操作、易于观察等特点，成为研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的侵染模型。线虫神经系统有302个神经元，免疫体系在抵抗致病菌及环境应激方面发挥作用的同时，也对神经及发育系统等产生影响[1]。与脊椎动物相比，线虫免疫体系简单并保守，有助于研究信号转导和天然免疫机制，此外可用于基于病毒相关微生物基因和免疫的宿主基因的鉴定[2]。铜绿假单胞菌是一种医院获得性、机会性、革兰氏阴性细菌，可引起多种疾病，包括免疫功能低下患者的急性感染和囊性纤维化患者的慢性肺部感染[3]。在临床水平上，铜绿假单胞菌能迅速产生抗生素耐药性并形成生物膜，因此治疗感染患者非常困难[4]。此外，铜绿假单胞菌是住院患者感染的常见病因，占所有医院感染的11%～14%，仅次于大肠杆菌和克雷伯菌[5]。铜绿假单胞菌感染通常具有较高的发病率和死亡率，尽管医院护理有所改善，但预后效果不良，死亡率为33%～61%，这给开发现有药物的替代抗菌策略带来了紧迫感[5]。本文综述了铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫侵染、宿主应对策略，为研究铜绿假单胞菌致病机制及筛选治疗其引发疾病的治疗思路提供了参考。

1 铜绿假单胞菌侵染秀丽隐杆线虫研究

1.1 铜绿假单胞菌侵染的影响

实验室常用的铜绿假单胞菌菌株有PA01、PA14等，其毒力因子系统包含2类。①分泌到细胞外，其中最具毒力的是Ⅲ型分泌系统[6-7]。②附着于细胞表面[8-9]。PA01对秀丽隐杆线虫具有较强毒力，饲喂后线虫存活时间比食物大肠杆菌OP50短约168 h。线虫发育经历L1～L4共4个时期，L4期的秀丽隐杆线虫在铜绿假单胞菌菌株PA14的毒性作用下更易感。铜绿假单胞菌侵染对线虫的生理造成严重影响，如生长发育变缓、运动能力下降、产卵量减少和体内脂肪含量降低等[10-11]。当然，不同铜绿假单胞菌菌株对线虫产生的影响不尽相同，PA14不同的存活状态会对线虫基因的表达造成影响[12]。如表1所示，将线虫置于热灭活前后的PA14中基因表达发生改变[13]。

表1 热灭活前后PA14诱导线虫基因表达

1.2 铜绿假单胞菌造成秀丽隐杆线虫死亡的类型及机制

铜绿假单胞菌是一种自由生活的变形菌，具有感染包括人类在内的多种动物宿主的能力，铜绿假单胞菌侵染后造成线虫死亡的类型主要包括快杀（Fast Killing）、慢杀（Slow Killing），麻痹致死（Paralytic Killing）和液体致死（Liquid Killing），详见表2。秀丽隐杆线虫是研究细菌致病性非常有价值的模型，当铜绿假单胞菌菌株PA14在线虫生长（NGM）培养基上生长时，培养基细胞定殖于线虫肠道，并在2～3 d内缓慢杀死线虫[10]。在慢杀的过程中，细菌通过群体感应（QS）调节途径参与毒力促进基因表达程序[13]，此外，ToxA毒素可抑制线虫蛋白质的翻译及合成[14]。相比之下，在高渗压培养基（PGS）上生长的PA14由于产生低分子量毒素，杀灭线虫的速度要快得多，一般在4～24 h内快速杀灭。另一株铜绿假单胞菌菌株PA01在BHI肉汤中生长时，可通过氰化物中毒从而麻痹性杀死线虫[15]。此外，NATALIA等使用NGC建立液体致死试验，将铜绿假单胞菌悬浮在补充有5 mg/mL胆固醇的S-basal中，调整OD，加入一定量线虫后，测定存活率。铁诱导的低氧致死反应在液体杀死线虫过程中起到关键作用[16]。

表2 铜绿假单胞菌造成秀丽隐杆线虫死亡的类型

近年来，研究发现在慢杀过程中，接触铜绿假单胞菌PA14后，秀丽隐杆线虫经历完整核糖体的快速丢失，伴随着在核糖体26S rRNA H69处切割的核糖体的积累。H69处的26S rRNA断裂不是对应激或细胞死亡的应激反应，而是特异于铜绿假单胞菌毒力的机制。H69的切割依赖于细菌毒力程序的基因调控，包括QS系统，且不依赖于ToxA介导的翻译抑制。H69核糖体裂解揭示了一种新的毒力机制，即铜绿假单胞菌可抑制动物宿主的蛋白翻译过程[17]。

2 秀丽隐杆线虫防御铜绿假单胞菌侵染应对策略

秀丽隐杆线虫常暴露于多种致病菌及多种未知危险的生存环境中，PA可以使线虫致死，线虫亦可以对PA侵染产生防御机制。秀丽隐杆线虫对PA主要通过由角质层组成的物理屏障、行为反应和秀丽隐杆线虫体内形成固有免疫防御系统的生理防御[18]。此外，当秀丽隐杆线虫接触到病原菌后的逃避行为也是必然选择[19]。

2.1 秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌的先天免疫反应

秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌的先天免疫反应主要通过以下信号通路实现，第1条信号通路由p38/MAPK通路介导，该途径由G蛋白α亚基（GPA）和磷酸化酶Cβ（PLCβ）调节肠道内p38 MAP激酶的活性抵抗病原菌侵染[20-21]。第2条信号通路由DBL-1介导，线虫中与哺乳动物转化生长因子β（TGF-β）通路同源的DBL-1参与线虫抵御病原菌侵染产生的免疫反应[22]。第3条信号通路由DAF-2/DAF-16介导，该通路高度保守，DAF-16是抵抗侵染的重要调节蛋白，线虫受到铜绿假单胞菌侵染后会激活DAF-2胰岛素样信号通路抑制宿主免疫[23]。此外，LET-7在线虫肠道或神经元中参与对PA14侵染固有免疫反应的分子调控[24]，在AIB中间神经元过表达NPR-9导致线虫对的防御机制降低[25]。

2.2 秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌逃避反应

秀丽隐杆线虫受到铜绿假单胞菌侵染后，会表现出逃离病原菌的行为，称之为逃避反应。根据逃避反应调控机制的不同，可分为应激性逃避行为（本能逃避）和学习型逃避行为。其中，TAX-4/TAX-2环鸟甘酸门控通道（TAX-4/TAX-2 cGMP-gated Channel）、胰岛素受体DAF-2、神经肽受体NPR-1和泛素化E3连接酶HECW-1则参与本能逃避行为，五羟色胺TPH-1、TGF-β信号通路配体DBL-1、DAF-7和胰岛素信号肽INS-6、INS-7参与调控线虫学习型病原逃避[19]。近年来研究发现miRNA miR-67参与了行为回避反应，铜绿假单胞菌PA14在线虫中诱导miR-67的表达，miR-67（n4899）突变体表现出规避铜绿假单胞菌PA14的能力降低[26]。

3 结语

铜绿假单胞菌等病原体通过释放毒素或改变动物宿主生理状态而有利于自身的侵染，在侵染过程中，产生如粘附分子、分泌系统和包括蛋白酶在内的毒性因子，增强致病和损害宿主组织的能力，其发病机制是毒力因子协调作用的表现。作为应对铜绿假单胞菌侵染的回应，秀丽隐杆线虫激活先天免疫，同时产生逃避反应。近期研究发现经典免疫基因pmk-1突变引起的先天免疫缺陷促进了线虫的逃避行为，pmk-1在OLL神经元中与E3泛素连接酶HECW-1共定位，并调节后者的表达水平，从而影响NPR-1的产生。当秀丽隐杆线虫对抗细菌感染时，一旦先天免疫受到损害，逃避的防御策略可通过HECW-1/NPR-1模块调控增强，提示神经回路中的GPCR可能接收来自免疫系统的输入，整合这两个系统以更好地适应不利环境[27]。铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫侵染模型为铜绿假单胞菌毒力因素、线虫的天然防御及对铜绿假单胞菌耐药机制的探索等方面研究提供更广泛的思路。