蒙药制剂额日敦·乌日勒质量标准研究*

杨雪苗，陈 希，徐楠冰，邬国栋，薄彧坤，杨 丹，安 明

(内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014040)

额日敦·乌日勒为蒙药复方制剂，别名珍宝丸，该处方由甘草、木香、栀子、诃子、川楝子、苘麻子、丁香、沉香等三十味名贵药材组成，该制剂已获得內药制字 M14020112 的批准文号。额日敦·乌日勒具有清热安神、舒筋活络的功效。主要用于治疗白脉病、半身不遂、风湿、类风湿、布病、肌筋萎缩、神经麻痹、肾脉损伤、瘟疫热病、久热不愈等疾病。额日敦·乌日勒现有的质量标准收载于《内蒙古蒙成药标准》1984版，但现有标准仅有性状和检查项，不能保证该药品的质量，拟增加薄层鉴别项和含量测定项以保证该制剂的质量。

该处方中甘草为君药，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效[1-2]。临床主要用于治疗脾胃虚弱、中气不足、咳嗽哮喘、缓和药物烈性、解药物毒性。木香属于理气药，具有行气止痛、健脾消食的功效。临床上主要用于胸胁、脘腹胀满、泻痢后重、不思饮食。栀子为清热泻火药，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功效，其活性成分栀子苷[3]具有缓泻、镇痛、利胆、抗炎等作用。因此，额日敦·乌日勒发挥主要药理作用与处方中甘草、木香、栀子间相互作用密切相关。

为进一步控制该药品质量，本实验采用薄层色谱(Thin Layer chromatography, TLC)法对处方中的甘草、栀子、木香进行定性鉴别，采用高效液相色谱(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC-UV)法对甘草中主要成分甘草苷、甘草酸[4]进行含量测定，并通过方法学考察，为完善蒙药制剂额日敦·乌日勒质量标准提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1仪器 Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)、BSA224S-CW 万分之一电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)、SQP 型十万分之一电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)、超纯水仪 (美国赛默飞世尔科技有限公司)、AS10200 超声波清洗机(40/60 Hz)(北京华瑞博远科技发展有限公司)、TDZ5-WS 多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2试药 样品(批号2009091、2009092、2009093)：本制剂由包头市蒙医中医医院提供。栀子苷对照品(110749-201919)、木香烃内酯(111524-201710)、去氢木香烃内酯(111525-201711)均由中国食品药品检定研究院提供。甘草苷对照品(AF21020853)、甘草酸铵对照品(批号AF21020859)、栀子对照药材(AF20102601)、甘草对照药材(AF20110113)均购自成都埃法生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，甲醇为色谱纯和分析纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3方法

1.3.1薄层鉴别

1.3.1.1栀子薄层鉴别 取额日敦·乌日勒丸4.6 g，加入50 %甲醇10 mL，超声处理40 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。依照处方比例称取缺栀子的阴性样品，同供试品溶液制法相同，即得阴性样品溶液。取栀子药材1.0 g和栀子对照药材1.0 g，同供试品溶液制法相同，即得栀子药材和栀子对照药材溶液。取一定量栀子苷对照品, 加乙醇制成每1 mL含有4 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则 0502)试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)为展开剂，展开、取出、晾干，再喷以10 %的硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。

1.3.1.2木香薄层鉴别 取额日敦·乌日勒丸3.5 g，加甲醇15 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。依照处方比例称取缺木香的阴性样品，同供试品溶液制法相同，即得阴性样品溶液。取木香对照药材0.5 g，同供试品溶液制法相同，即得木香对照药材溶液。分别取一定量去氢木香内酯对照品、木香烃内酯对照品，加甲醇分别制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则 0502)试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 G 薄层板上，以环己烷 - 甲酸乙酯 - 甲酸(15∶ 15∶ 1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1 %香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。

1.3.1.3甘草薄层鉴别 取额日敦·乌日勒丸6.9 g，加乙醚40 mL，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。依照处方比例称取缺甘草的阴性样品，同供试品溶液制法相同，即得阴性样品溶液。取甘草药材1 g、甘草对照药材1 g，同法制成药材溶液、对照药材溶液。取甘草酸铵对照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则 0502)试验，吸取上述溶液各1～2 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶ 1∶ 1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置荧光灯(256 nm)下检视。

1.3.2含量测定

1.3.2.1色谱条件 选用以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱：依利特SinoChrom ODS-BP色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1 %磷酸溶液为流动相B，按照表1色谱条件进行梯度洗脱；流速为0.8 mL/min，柱温为 25 ℃，进样体积为 10 μL ，在237 nm的波长下进行检测。理论塔板数按甘草苷峰计算应不低于5 000。

表1 梯度洗脱条件

1.3.2.2对照品溶液的制备 精密称取甘草苷对照品2 mg, 置10 mL容量瓶中，加70 %乙醇溶解并稀释至刻度，再精密吸取1 mL至10 mL 容量瓶中，用70 %乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。称取甘草酸铵对照品2 mg，置10 mL 容量瓶中，加70 %乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207)。

1.3.2.3供试品溶液的制备 称取蒙药额日敦·乌日勒丸适量，置于研钵研细，取本品粉末(过三号筛)约1.39 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %乙醇20 mL ，密塞，称定重量，超声处理30 min，冷却，再称定重量，用70 % 乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.2.4阴性溶液的制备 按照蒙药额日敦·乌日勒处方比例称取除甘草以外的其它药材，充分研细混匀，参照“2.2.3”项下的方法制成(缺甘草)的阴性对照溶液。

2 结果

2.1薄层鉴别

2.1.1栀子薄层鉴别 在薄层色谱中，供试品溶液与对照药材溶液色谱、对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图1。

图1 蒙药额日敦·乌日勒中栀子的TLC图谱

2.1.2木香薄层鉴别 在薄层色谱中，供试品溶液与对照药材溶液色谱、对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图2。

图2 蒙药额日敦·乌日勒中木香的TLC图谱

2.1.3甘草薄层鉴别 在薄层色谱中，供试品溶液与对照药材溶液、对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。见图3。

图3 蒙药额日敦·乌日勒中甘草的TLC图谱

2.2含量测定

2.2.1提取效率考察 取额日敦·乌日勒丸适量，置于研钵研细，取本品粉末(过三号筛)1.39 g，精密称定3份，超声时间分别设置为20、30、40 min，按“2.2.3”项方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样，根据色谱图结果用外标法计算出甘草苷、甘草酸的含量。试验结果见表 2。

表2 各组分提取时间考察

2.2.2专属性考察 精密吸取额日敦·乌日勒供试品、甘草苷对照品、甘草酸铵对照品、额日敦·乌日勒阴性对照溶液适量，按照“2.2.1”项条件进样检测。甘草苷、甘草酸的色谱峰分离效果良好，并且阴性对照没有干扰。试验结果见图4～6。

图4 蒙药额日敦·乌日勒供试品溶液色谱图

图5 甘草苷对照品色谱图(A)、甘草酸对照品色谱图(B)

2.2.3线性关系的考察 取浓度为8.7 μg/mL甘草苷溶液0.435 mL，浓度为44.32 μg/mL甘草酸溶液2.216 mL，将上述溶液放置10 mL容量瓶，用70 %乙醇溶解，即得到储备液。精密量取储备液适量，加70 %甲醇稀释制成系列浓度的对照品溶液，参照“2.2.1”项下色谱条件进样检测。以色谱峰面积A为横坐标，质量浓度C为纵坐标，绘制标曲线。结果表明甘草苷在浓度为0.00348～0.01218 mg/mL的范围内，呈现出了良好的线性关系。甘草酸在浓度0.017723～0.06205 mg/mL的范围内，呈现出了良好的线性关系。试验结果见表3。

表3 各组分线性回归方程

2.2.4精密度试验 取“2.2.3”项下供试品溶液10 μL，连续进样6针，测得甘草苷峰面积值RSD %为0.36 %，甘草酸峰面积值RSD %为0.55 %，表明仪器精密度良好。

2.2.5重复性试验 取同一批号(2009091)样品，按“2.2.3”项方法平行配制供试品溶液6份， 按“2.2.1”项色谱条件连续进样，记录色谱图峰面积，用外标法计算甘草苷、甘草酸含量并计算 RSD 值，RSD<4.0 %，在规定范围内，表明该试验方法的重复性好。试验结果见表 4和表 5。

表4 甘草苷重复性试验

表5 甘草酸重复性试验

2.2.6稳定性试验 精密称定样品粉末1.4 g，以“2.2.3”项方法制备供试品溶液，室温放置，分别在0、4、8、12、24 h按照“2.2.1”项条件进样，试验结果见表6，表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定，且RSD<4.0 %,该方法可行。

表6 稳定性试验结果

2.2.7加样回收试验 取同一批号(2009091)样品，精密称定 9 份，每份 0.69 g，分为3组，每组分别加入供试品含量的 50 %、100 %、150 %的对照品溶液，按“2.2.3” 项方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样，记录甘草苷、甘草酸的色谱峰面积，并按外标法计算甘草苷、甘草酸含量、平均回收率，平均回收率在规定范围内(85 %～110 %)，且RSD<4.0 %。试验结果见表7，表明该方法准确度好。

2.2.8耐用性的考察 换不同厂家、不同型号色谱柱，取供试品约1.39 g，精密称定，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样，按外标法计算甘草苷、甘草酸含量，RSD<4.0 %。试验结果见表8。

2.2.9样品含量测定 取三个批号的样品(2009091、2009092、2009093)及实验室自制模拟样品一份，4个样品各取 3 份，按照“2.2.3”项方法制备供试品溶液，分别精密量取各溶液 10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定, 记录甘草苷、甘草酸的色谱峰面积，以外标法计算样品中甘草苷、甘草酸的含量，并求RSD值，各项下RSD<4.0 %。试验结果见表9。

表7 各组分加样回收实验

表8 耐用性考察

表9 含量测定

3 讨论

3.1薄层板的选择 在甘草TLC鉴别中，分别考察了硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板、硅胶H薄层板对甘草酸的分离能力，结果表明硅胶GF254板中甘草酸斑点显示清晰，分离度良好，阴性溶液无干扰。因此在甘草TLC中选择硅胶GF254薄层板对甘草酸进行定性鉴别。

3.2流动相的选取 流动相的选择参照《中国药典》2020年版一部卷柏中甘草苷、甘草酸含量测定，结合文献，以乙腈- 0.05 %磷酸溶液进行梯度洗脱(0～8 min,19 %乙腈；8～35 min, 19 %～50 %乙腈；35～36 min, 50 %～100 % 乙腈；36～40 min，100 %～19 %乙腈)，在此条件下甘草苷、甘草酸分离效果不理想。鉴于以上，本研究增加磷酸水溶液的浓度并改变流动相的梯度，以乙腈-0.1 %磷酸水溶液进行梯度洗脱(0～6 min, 19 %乙腈；6～12 min，19 %～25 %乙腈；12～16 min，25 %～27 %乙腈；16～20 min，27 %～36 %乙腈；20～33 min，36 %～47 % 乙腈；33～36 min，47 %～19 %乙腈)，结果表明在此条件下蒙药制剂额日敦·乌日勒中甘草的主要成分甘草苷、甘草酸保持良好的峰形，各峰分离度良好，该方法专属性强，准确度高、重复性好，因此，最终使用乙腈- 0.1 % 磷酸水溶液作为本研究的流动相[5]。

3.3检测波长的选择 取“2.2.3”项下的溶液，在200～500 nm下通过二极管阵列检测器做全波长扫描，甘草苷、甘草酸分别在198 nm、256 nm处有最大吸收。查阅文献并参考《中国药典》2020版卷柏中甘草苷、甘草酸的含量测定，在237 nm下考察甘草苷、甘草酸的吸收情况，结果显示各峰均有吸收并保持良好的峰型，故最终选择 237 nm 作为本研究的检测波长。

3.4流速的选择 参照2020 年版《中国药典》，结合相关文献，考察了不同流速对甘草苷、甘草酸的分离效果。本研究分别考察了流速为0.6、0.8、1.0 mL/min时各峰的出峰情况，结果表明甘草苷、甘草酸在流速为0.8 mL/min时，基线稳定，各峰峰形、分离度良好，因此选择流速为0.8 mL/min时对甘草苷、甘草酸进行定量分析。

综上所述，本研究建立了蒙药制剂额日敦·乌日勒中甘草、栀子、木香TLC定性鉴别的方法，该方法重现性好、专属性强。采用HPLC法建立了蒙药制剂额日敦·乌日勒中甘草的主要药效成分甘草苷、甘草酸含量测定方法，该方法专属性强、灵敏度高、重复性好。因此，本研究成功地将蒙药制剂额日敦·乌日勒质量标准进行完善，该方法可用于蒙药制剂敦·乌日勒的质量控制[6]。