铜绿假单胞菌毒力基因与耐药性关系分析*

孙慕溱，曹 梅，张 龙，魏取好,2

(1.安徽理工大学医学院，安徽 淮南 23200；2.上海市奉贤区中心医院检验科)

铜绿假单胞(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一种革兰阴性条件致病菌，可以定植在人体的不同部位和组织，常见于烧伤或创伤部位、中耳道、角膜、尿道和呼吸道。作为院内感染的常见病原菌，随着抗菌药物的使用，铜绿假单胞菌耐药率不断增加，多重耐药 (multi-drugresistant，MDR)菌株检出率逐年增高，成为临床抗感染治疗的难点之一[1-2]。在铜绿假单胞菌的致病机制中，Ⅲ型分泌系统(Type 3 secretion system，T3SS)可以改变信号转导途径，逃避宿主防御系统进并破坏免疫系统，最终导致宿主细胞死亡[3]，具有重要的作用。其T3SS分泌系统分泌四种毒力蛋白，exoY可以使内皮细胞的完整性丧失[4-5]；exoS可以破坏肌动蛋白细胞骨架的重排[6]；exoT可以抑制中性粒细胞[7]；exoU可以破坏宿主细胞的细胞膜[6]。这些毒力因子的存在会增加患者潜在致命性感染的风险[8]。

鉴于多重耐药菌株对临床的威胁，以及这些菌株产生的毒力因子在疾病感染过程中的重要性，对毒力因子的检测有助于患者的治疗和预后。本研究拟对临床分离的铜绿假单胞菌携带的毒力基因exoT、exoY、exoS和exoU进行检测，探讨其与细菌耐药性的关系。

1 材料与方法

1.1菌株 收集上海市奉贤区中心医院2016年4月-2018年4月临床样本非重复分离的铜绿假单胞菌株157株。所有菌株均采用美国BD公司生产的Phoenix 100全自动微生物分析仪进行鉴定。

1.2主要试剂和仪器 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒、纯水(HPLC级)、溴化乙锭(EB)、DNA Marker DL500购自生工生物工程(上海)有限公司，rTaq Premix购自大连TAKARA公司，胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司。ABI Verti型PCR仪为Applied Biosystems公司产品，Syngene·G-BOX-EF2型凝胶成像仪为基因公司产品。核苷酸引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成，引物序列及扩增片段大小见表1。

表1 核苷酸引物的序列

1.3药物敏感试验 采用美国BD公司的Phoenix 100全自动微生物分析仪进行药敏分析，按美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2021年版标准判断结果。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.4细菌基因组DNA提取 将临床分离菌株划线接种于血平板上，置于温箱37 ℃过夜培养，挑取单个菌落接种于LB液体培养基中，置于37 ℃恒温摇床200 r/min振荡培养过夜，取1.5 mL菌液室温12 000 r/min离心2 min，弃上清，收集菌液沉淀，使用柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提细菌基因组DNA，纯水(HPLC级)洗脱后置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.5T3SS毒力基因检测 以抽提的细菌DNA为模板，采用PCR法分别检测exoS、exoU、exoT和exoY 4种毒力基因。PCR反应体系：共20 μL，其中上下、游引物(10 μm)各0.4 μL，DNA模板1 μL，rTaq Premix 10 μL，纯水(HPLC级)8.2 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min，随后94 ℃变性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。经3 %琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像仪拍照分析并记录结果。

1.6统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件，相关性分析采用Spearman分析，P<0.05为差异具有统计学意义。组间比较采用Fisher检验， Bonferroni校正后P<0.0167差异具有统计学意义。

2 结果

2.1标本类型来源及科室分布 临床分离的157株铜绿假单胞菌株主要来自普外科病区(80株，50.96 %)，其次是神经外科(28株，17.83 %)、急诊内科(16株，10.19 %)、普内科(9株，5.73 %)和呼吸内科(7株，4.46 %)等科室。146株分离来自于痰液或咽拭子， 5株分离自尿液、4株分离自分泌物、2株分离自腹水。

2.2铜绿假单胞菌耐药性 157株铜绿假单胞菌对亚胺培南、环丙沙星、头孢他啶的耐药率>20 %，分别为28.03 %(44/157)、26.11 %(41/157)和21.66 %(34/157)，对哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星和头孢吡肟的耐药率均为19.75 %(31/157)，对庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素的耐药率均<5 %，分别为3.82 %(6/157)、1.27 %(2/157)和1.27 %(2/157)。

2.3T3SS毒力基因的分布 157株临床分离的铜绿假单胞菌中，携带exoT、exoY、exoS、exoU的阳性率分别为100.00 %(157/157)、95.54 %(150/157)、70.06 %(110/157)、28.03 %(44/157)，部分PCR扩增产物电泳结果如下(图1)。共检测出6种T3SS基因型分型，主要为exoT+/exoY+/exoS+/exoU-(68.79 %，108/157)和exoT+/exoY+/exoS-/exoU+(25.48 %，40/157)，未发现exoU+ /exoS+型菌株，见表2。

图1 毒力基因 exoT、exoY、exoS和exoU的PCR产物电泳图

表2 157 株铜绿假单胞菌分离株 T3SS 基因型分布

2.4毒力基因与耐药性

2.4.1毒力基因与常用抗菌药物的关系 毒力基因与耐药表型之间的相关性分析如下表所示， exoT和exoY与抗菌药物没有相关性， exoS和exoU与左氧氟沙星、亚胺培南、环丙沙星有相关性(P<0.05)，见表3。

表3 毒力基因与常用抗菌药物表型的相关性

2.4.2毒力基因型与常用抗菌药物的关系 临床分离的157株铜绿假单胞菌中，有42株为 MDR-PA；分析这些菌株所携带的毒力基因的基因型和抗菌药物耐药率，其中以exoT+/exoY+/exoS+/exoU-基因型菌株为主，对亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率均低exoT+/exoY+/exoS-/exoU+基因型菌株；对哌拉西林/他唑巴坦和头孢吡肟的耐药率均高于exoT+/exoY+/exoS-/exoU+基因型菌株，差异具有统计学意义(P<0.0167)(图2)。44株为耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant P.aeruginosa, CR-PA)。由于exoT和exoY在CR-PA中均表达，因此只对exoS和exoU的不同组合类型的基因型与抗菌药的耐药率进行比较分析；结果表明exoS-/exoU+基因型菌株对环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率高于exoS+/exoU-基因型菌株，差异具有统计学意义(P<0.0167)，见图3。

图2 MDR-PA毒力基因型与常用抗菌药物耐药率

图3 CR-PA毒力基因型与常用抗菌药物耐药率

3 讨论

3.1毒力基因的携带情况 本研究对临床分离的157株铜绿假单胞菌进行检测，结果与Feltman等[10]报道的一致，几乎所有菌株都能检测到T3SS型分泌系统。铜绿假单胞菌全都携带exoT基因，这是因为它在该菌中具有更加保守的作用，对疾病的致病机制起到基础性作用[11]。而绝大多数都携带exoY(95.54 %)，它广泛存在于铜绿假单胞菌的生物膜中[11]，生物膜的形成造会使疾病反复并难以治愈。铜绿假单胞菌中普遍携带exoT和exoY，然而exoS和exoU的携带情况则明显不同，分别为70.06 %和28.03 %。尽管exoU的携带率最少，但其细胞毒性是exoS的100倍[12]。Schulert 等[2]的研究表明exoU 的分泌可用作高毒株的标志物与菌株的传播以及致病性密切相关，并且可能和不良的临床结果有一定的关联。本研究没有发现同时携带exoS和exoU的菌株，与Ozer 等[13]报道的一致，以exoS+/exoU-基因型菌株更为常见。这可能与标本类型以痰液为主有关，且exoS基因在呼吸道感染中起到重要作用[14]。T3SS型分泌系统在铜绿假单胞菌的临床分离株中广泛存在，这表明该系统在细菌的致病机制和过程中发挥着重要作用。

3.2毒力基因携带与耐药的关系 作为院内感染的常见病原菌，随着抗菌药物的使用，铜绿假单胞菌耐药率不断增加，MDR检出率逐年增高。MDR-PA引起的感染是临床上治疗和管理的主要问题。本研究中，42株为MDR-PA，以exoT+/exoY+/exoS+/exoU-基因型为主，与Hassuna等[15]报道结果一致。44株CR-PA，主要以exoT+/exoY+/exoS-/exoU+基因型的菌株为主。碳青霉烯类药物被认为是治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染的最后手段，碳青霉烯类耐药性的出现限制了其在治疗中的应用[16]。通过基因型组合与耐药性的分析，结果显示exoT+/exoY+/exoS+/exoU-基因型菌株对亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率均低exoT+/exoY+/exoS-/exoU+基因型菌株，这与Agnello等[17]报道一致。exoT+/exoY+/exoS-/exoU+型菌株对喹诺酮类药物具有较高的耐药性可能与该型菌株存在gyrA基因突变和外排泵过度表达EPO 表型有关[17-18]。

本研究发现不同毒力基因型组合与临床铜绿假单胞对常用抗菌药物的耐药率密切相关。通过对T3SS分泌系统的调节机制、致病机制及其与耐药性关系的研究，毒力因子或将成为抗感染治疗的新靶位，对患者的诊疗、指导临床合理用药和避免医院感染发生具有重要的临床意义。