复方延胡索微乳凝胶贴膏的提取及镇痛抗炎作用

李 燕 王慧凯 王 滨 宋春晓 宫凯凯 邢树礼 满玉清

1 滨州医学院附属医院药学部 山东 滨州 256603；2 滨州市中医院脑病科 山东 滨州 256601；3 滨州医学院附属医院医学研究中心 山东 滨州 256603

复方延胡索粉剂(当归、桂枝、鸡血藤、延胡索)在临床上可用于骨关节炎的治疗。使用前将这四种药物混匀、研细成粉，热醋调匀，现用现配，涂布于空心贴，固定于患处。该粉剂使用多年，疗效较好，得到临床的一致好评，但在使用中存在一系列问题，如操作繁琐，大大增加了医护人员的时间成本，易污染衣物、贴敷期间活动受限，患者依从性较差。为解决上述问题，本研究拟将其制成复方延胡索微乳凝胶贴膏。因当归、桂枝含挥发性物质较多，为提高其稳定性，本研究另文阐述。本文侧重于研究延胡索和鸡血藤的提取及工艺优化，为使提取液最大限度地发挥镇痛、抗炎药效，以延胡索乙素、延胡索总生物碱、鸡血藤总黄酮作为提取指标[1-5]，采用星点设计得出最佳工艺流程，并通过醋酸致扭体反应、二甲苯致耳肿胀实验[6-9]对提取物进行镇痛抗炎作用研究。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级昆明种小鼠100只，雌雄各半，体质量为(19.60±1.12)g，由滨州医学院实验动物中心提供合格证号为SCXK(鲁)20200007，饲养于铺垫锯末塑料盒内，每笼10只饲养，保持环境室温在(23±2)℃，12 h/12 h 昼夜节律，自由摄食饮水。

1.2 仪器与试剂 KH7200型超声清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司)，UV-1800型紫外分光光度计(日本岛津公司)，安捷伦LC1100高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，延胡索乙素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号为B21426)，鸡血藤(河北安国市腾越药业有限公司，批号为20200003)，延胡索(河北安国市腾越药业有限公司，批号为20200103)，地塞米松磷酸钠注射液(1 ml∶5 mg，湖北天药药业股份有限公司，批号为52107251)

本研究所用药材经滨州市中医院著名老中医王君教授鉴定。延胡索Corydalis Rhizoma为罂粟科多年生草本植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang 的干燥块茎。鸡血藤系豆科植物密花豆 Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎。所留存标本均收置于滨州医学院附属医院标本室。

2 方法

2.1 不同提取方式提取液的制备 延胡索的主要药效物质为延胡索总生物碱[10-13]，其中，延胡索乙素行气、镇痛作用尤为突出，经醋制后延胡索多种生物碱含量均有不同程度地提高[14]，延胡索乙素的稳定性也增强[15]。为提高有效物质的浸出率，提取前取适量延胡索饮片，加适量醋拌匀，闷透，置炒制容器内炒至醋全部吸收，取出，放凉备用。

2.1.1 连续回流提取 称取当归、桂枝经提取后的干燥药渣粉末5 g、鸡血藤2.5 g、延胡索5 g，用一定体积分数的乙醇浸泡至透心，补足吸水率，进行连续回流提取。

2.1.2 加热回流提取 准确称取当归、桂枝经提取后的干燥药渣粉末5 g、鸡血藤2.5 g、延胡索5 g，用一定体积分数的乙醇浸泡至透心，补足吸水率，进行加热回流提取。

2.1.3 水煎煮提取 准确称取当归、桂枝经提取后的干燥药渣粉末5 g、鸡血藤2.5 g、延胡索5 g，加蒸馏水浸泡至透心，补足吸水率，进行水煎煮法提取。

2.2 含量测定

2.2.1 延胡索乙素含量测定

2.2.1.1 色谱条件及系统适应性 waters C18色谱柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，乙腈-磷酸三乙胺水溶液(每1000 ml水加1 ml磷酸，用三乙胺调pH值为6.0)(41∶59)为流动相；检测波长280 nm，进样量为20 μl。

2.2.1.2 对照品溶液配制 取适量延胡索乙素对照品，甲醇定容，配制383.2 μg·ml-1的对照品溶液。

2.2.1.3 供试品溶液配制及含量测定 精密吸取“2.1”项下三种样品液各1 ml，甲醇稀释，0.45 μm滤膜滤过，进样，计算延胡索乙素含量及提取率。提取率=提取液中延胡索乙素含量/延胡索饮片质量。

A.连续回流提取；B.水煎煮提取；C.热回流提取。

2.2.1.4 线性关系考察 取对照液适量，甲醇定容，配制30.7、61.4、92.1、122.8、184.2 μg·ml-1系列浓度，进样，定义X为浓度，Y为峰面积作标准曲线，得Y=18 655X-18 172，R2=0.9995 ，于30.7～184.2 μg·ml-1范围内线性关系良好。

2.2.1.5 精密度考察 精密吸取“2.1”项下同批次、同浓度的供试液适量，0.45 μm微孔滤膜过滤，重复进样6次，记录色谱峰面积，经计算得RSD为0.31%。

2.2.1.6 稳定性考察 精密吸取“2.1”项下同批次、同浓度的供试液适量，于制备后第0、2、4、6、8、12、18、24 h进样，记录峰面积，经计算得RSD=0.88%。这说明，供试液于该时段内稳定性良好。

2.2.1.7 重复性试验 按照“2.1.1”项下方法制做供试液6份，进样，计算延胡索乙素含量，RSD=1.46%。

2.2.1.8 加样回收率实验 精密称取样品粉末12.5 g，共6份，每份加入等同于样品含量的延胡索乙素对照品，按“2.1.1”项下同法制备供试液，进样经计算得平均回收率为99.45%，RSD=1.75%。

2.2.2 延胡索总生物碱含量测定[16]

2.2.2.1 对照品溶液制备 取适量延胡索乙素对照品，pH值为4.5的醋酸-醋酸钠溶液定容，配制320 μg·ml-1对照液。

2.2.2.2 显色方法及检测波长的测定 取10 ml三氯甲烷于分液漏斗，依次加入对照液0.3 ml、醋酸-醋酸钠溶液0.7 ml、溴甲酚绿溶液4 ml，振摇至有机层颜色不再加深，静置40 min，取有机层进行全波扫描[8]，得最大吸收波长为410 nm。

2.2.2.3 标准曲线绘制 分别配制0.00、2.56、5.12、10.24、12.8、20.48 μg·ml-1系列浓度的对照液，测吸光度，定义X为进样浓度，Y为吸光度作标准曲线，得Y=0.043 0X-0.0655，R2=0.999 8，于2.56 ～12.80 μg·ml-1范围内线性关系良好。

2.2.2.4 供试液含量测定 分别精密吸取“2.1”项下的三种提取液并适当稀释，按“2.2.2.3”项下操作，计算含量。

2.2.3 鸡血藤总黄酮含量测定

2.2.3.1 对照品溶液制备 取适量芦丁对照品，60%乙醇溶液定容，配制204.8 μg·ml-1对照液。

2.2.3.2 检测波长的确定[17]取对照液适量，用亚硝酸钠-硝酸铝法显色。以60%乙醇溶液作空白对照，全波长扫描，测得最大吸收波长为490 nm。

2.2.3.3 标准曲线绘制 吸取芦丁对照液0.0、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0 ml于6只25 ml容量瓶，按“2.2.3.2”项下操作测吸光度，定义浓度为X、吸光度值为Y作标准曲线，得Y=0.012X-0.005，R2=0.999 5，于8.192 ～57.344 μg·ml-1范围内线性关系良好。

采用营养钵育苗，营养钵直径8厘米、高10厘米，每钵播1粒种子，播后盖上厚0.5～1厘米的基质，每亩大田需备营养钵约2500个。当出苗率达50%时，春季及时揭除营养钵上塑料薄膜，夏秋季通过开关通风口、开合遮阳网，合理调节棚室温度，保持23℃左右。及时做好调水、通风、换气工作。

2.2.3.4 供试液含量测定 吸取“2.1”项下三种提取液并稀释，按“2.2.3.2”项下操作，计算鸡血藤总黄酮含量。

2.2.4 干浸膏得率的测定 取“2.1”项下三种提取液各30 ml，干燥至质量恒定，计算干浸膏得率。干浸膏得率=mV∕(30M)×100%。M为干浸膏质量，V为提取液总体积，M为饮片总质量。

2.3 模糊层次分析法建立指标评价体系 根据前期试验结果，确定延胡索总生物碱提取率、延胡索乙素提取率、鸡血藤总黄酮提取率、干浸膏得率为检测指标。建立多层次递阶结构模型 确定最优提取工艺为目标层(O)，有效成分提取率为指标层(X)，延胡索乙素提取率(Y1)，延胡索总生物碱提取率(Y2)，鸡血藤总黄酮提取率(Y3)，干浸膏得率(Y4)为方案层。

构造正互补判断矩阵 根据1-9标度法构建方案层(X)对于准则层(Y)的正互补判断矩阵A=

模糊层次总排序W=W(3)×W(2)，其中W(2)即指标层对目标层的排序向量，本实验中指标层为有效成分提取率，W(2)=[1]，复方延胡索微乳凝胶贴膏最优提取工艺评价模W=0.288x1+0.271x2+0.238x3+0.204x4型，其中x1为延胡索乙素提取率，x2为延胡索总生物碱提取率，x3为鸡血藤总黄酮提取率，x4为干浸膏得率。

2.4 提取方式的优化 以提取时间、溶剂倍数、溶剂体积分数、浸泡时间为考察对象，延胡索乙素、延胡索总生物碱、鸡血藤总黄酮提取率和出膏率为指标进行单因素考察。

2.4.1 单因素试验 以延胡索乙素、延胡索总生物碱、鸡血藤总黄酮提取率和干浸膏得率为评价指标，考察提取时间(A)、溶剂倍数(B)、乙醇体积分数(C)、浸泡时间(D)的高低水平。

2.4.2 星点设计优化 提取工艺采用3因素3水平的星点设计优化提取工艺。

2.4.3 抗炎、镇痛作用研究

2.4.3.1 镇痛作用研究 50 只小鼠雌雄各半，随机分成模型对照组(30%乙醇溶液)，地塞米松注射液组，用30%乙醇溶液制成的提取物低、中、高剂量组(生药1.5、2.4、19.2 g·kg-1)，将各小鼠于实验前24 h剃除腹毛，每天固定时间经皮给药2次，共5 d。于第5天用药后20 min均腹腔注射0.6%乙酸0.2 mL/只，观察并记录注射后20 min内小鼠的扭体次数[8]。

2.4.3.2 抗炎作用研究 50 只小鼠雌雄各半，随机分成模型对照组(30%乙醇溶液)，地塞米松注射液组，用30%乙醇溶液制成提取物低、中、高剂量组(生药1.5、2.4、19.2 g·kg-1)，分别于每天固定时间在各组小鼠右耳均匀涂抹相应药物，每天2次，共5天，于最后一次用药后20 min，在每只小鼠右耳内外两侧涂抹20 μL二甲苯，40 min后处死，沿耳廓剪下双耳，用打孔器分别在左右耳相同部位打下同样大小的耳片，称重，计算肿胀度和肿胀抑制率[9]。

3 结果

2.1 提取方式的优选 由表1可知，三种提取方式中，连续回流提取法所得综合评分值最高，与热回流提取法相比，该法溶剂消耗更少，提取效率更高。水煎煮提取法综合评分值最低。最佳提取方式为连续回流提取法。

表1 三种提取方式的比较

2.2 单因素实验 各指标在提取4～6 h内均处于较高水平，因此应选择提取时间为6、4 h。同理，确定溶剂倍数为22、18倍，乙醇体积分数为80%、60%。浸泡时间对延胡索乙素、总生物碱、鸡血藤总黄酮提取率的影响不显著。干浸膏得率随着浸泡时间的延长先增大后减少。综合考虑时间成本等因素，确定浸泡时间为0 min(图2)。

1.延胡索乙素提取率；2.延胡索总生物碱提取率；3.鸡血藤总黄酮提取率；4. 干浸膏得率。

2.3 醇提工艺的优化 利用星点设计进行醇提工艺优化，因素水平设置及实验结果见表2、3。

表2 星点设计实验因素水平

表3 Box-Behnken设计实验结果

运用design expert.V8.0.6对提取时间(A)、溶剂倍数(B)、乙醇体积分数(C)进行回归拟合：Y=-110.9+13.79A+4.848B+1.054C-0.016 25AB-0.002 275AC+0.000 687 5BC-1.291A2-0.116 1B2-0.007 756C2。

根据方差分析结果(表4)，失拟项(P=0.078 44>0.05)，差异无统计学意义，R2=0.995 5，Radj2=0.989 8，说明该模型对本实验的拟合度较高，与实际实验数值误差小，可解释98.98%响应值的变化，因此可作为模型准确预测各评价指标的数值。通过比较F值，各考察指标对综合评分值影响能力由大到小为：A(提取时间)>B(溶剂倍数)>C(乙醇体积分数)。

表4 回归模型方差分析

以各考察因素为响应因子，综合评分值为响应值绘制曲线图与等高线图(图3)，曲面图越陡峭，等高线越密集，相应两因素的交互作用对综合评分值的影响越大。通过对二项式回归模型的分析预测结合实际得出最优提取工艺：加入21倍68 %的乙醇，连续回流提取5 h，此条件下的综合评分预测值W=9.637。

A. 提取时间；B.溶剂倍数；C.乙醇体积分数。

表5 验证性实验

3.4 镇痛实验 云南白药膏组、提取物低、中、高剂量组小鼠扭体次数比模型对照组少，这表明，提取物有一定的镇痛作用，且在一定范围内随着浓度增大，镇痛作用增强(表6)。

表6 扭体法实验结果

3.5 抗炎作用实验 提取物低、中、高剂量组和云南白药膏组小鼠均比模型对照组的耳肿胀率低，这表明，提取物有一定的抗炎作用，且在一定范围内随着浓度增大，抗炎作用增强(表7)。

表7 二甲苯致耳肿胀实验结果

4 讨论

本研究考察了醇提、水提两种提取方式对延胡索乙素、延胡索总生物碱、鸡血藤总黄酮提取率的影响，实验结果表明，三者提取率由高到低依次为：连续回流提取>热回流提取>水煎煮提取，连续回流提取的效率最高，目标物质在一定比例的乙醇水溶液中溶解度较高。

黄酮类化合物分子中的3-羟基、5-羟基或邻二酚羟基易与金属盐反应，生成有色金属络合物，通过比色法可测得总黄酮含量[18-20]。黄红泓等[21]在采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定鸡血藤总黄酮时发现，鸡血藤阴性提取液呈淡红色，这提示，除鸡血藤外，其他药物在提取过程中也释放出少量黄酮类物质。因此，在测定鸡血藤总黄酮含量时，以鸡血藤阴性溶液代替空白溶剂作参照物更为精确。

模糊层次分析法(fuzzy analysis hierarchy process，FAHP)是由20世纪70年代美国运筹学教授T.L.Saaty提出的系统性分析方法。FAHP是一种实用性很强的决策方法，它将模糊综合评价法的包容性与层次分析法定量性和客观性的优点有机融合，将与决策相关的因素分为目标层、准则层、方案层，构造模糊判断矩阵，并通过一致性检验确定合理性，得出权重值，计算各方案综合评分值来确定优劣次序。FAHP既考虑主观性，又兼顾各指标实验数据之间的关系，为中药提取工艺的优化提供了新的思路和方法[22-23]。

综上所述，优化后的提取工艺操作简单、稳定可靠，提取物具有良好的镇痛抗炎药效，为复方延胡索微乳凝胶贴膏的制剂开发提供了思路。