炎性环境下DHA对直肠癌细胞增殖和克隆形成的影响

黄荔丰 钟 伟

漳州卫生职业技术学院转化医学检测应用技术协同创新中心 福建 漳州 363000

ω-3多不饱和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFAs)在促进健康和降低疾病风险方面发挥着各种作用。ω-3 PUFAs包括α-亚麻酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、二十碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)[1]。DHA/EPA等ω-3 PUFAs可以降低结直肠癌(colorectal cancer, CRC)风险、抑制转移以及降低抗肿瘤药物的毒性等有益作用。然而，也有文献[2]报道ω-3 PUFAs对于CRC没有效果甚至具有反作用。因此，进一步了解ω-3PUFAs的抗炎抗癌作用分子机制有助于阐明其潜在的健康促进作用，为其使用注意事项提供科学依据。

富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5，Lgr5)是结肠干细胞的重要标志蛋白[3]。单纯的靶向Lgr5+结肠癌干细胞只能达到暂时抑制肿瘤的效果，而一旦停止靶向肿瘤干细胞，周围细胞则可能通过肿瘤炎性微环境的影响补充结肠癌干细胞，使得肿瘤继续生长[4-5]。找到同时具有抑制直肠癌干细胞又有抗炎抑制炎性微环境对直肠癌细胞的去分化作用的双重功能的药物具有重要意义。DHA不仅具有抗炎的作用，也有治疗肿瘤的效果。因此，本研究旨在通过TNF-α模拟炎性微环境，探讨DHA对直肠癌细胞的双重作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与器材 L-15细胞培养液和0.5%胰酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)购自GIBCO公司；胎牛血清购自GEMINI公司；兔抗人LGR5(ab75850)、cyclin D1(ab134175)抗体购自Abcam公司；兔抗人p65(8242S)、p-p65(3033S)、β-actin(3700S)抗体购自CellSignaling Technology公司；细胞总RNA提取试剂盒购自天根生物科技有限公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自Promega公司；TNF-α重组蛋白购自PeproTech公司。DHA购自Sigma公司。DHA 以无水乙醇配制成浓度100 mol/ml的贮存液，-70 ℃避光保存。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人直肠腺癌细胞株SW480和SW620来源于中国科学院细胞库，细胞贴壁培养于含10% 胎牛血清的L-15培养基中，置于37℃、100%空气条件下培养。

1.2.2 MTT细胞活力检测 取对数生长期的SW480和SW620细胞，以104个/孔接种于96孔板，加入DHA，使终浓度分别为0、25、50、100 mol/L，每个浓度设3 个平行孔。于37℃、100%空气条件下别培养20 h，加入20 L MTT 溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，小心吸去上清液，加入150 L DMSO，室温摇床孵育10 min，然后使用酶标仪测定490 nm处的吸光度。

1.2.3 荧光定量PCR 直肠癌细胞经实验处理后，以磁珠法提取总RNA。用以上提取的总RNA作为模板，采用Promega的反转录试剂盒进行反转录，然后以cDNA为模板，采用荧光定量PCR试剂盒说明配制PCR反应体系，用ABI 公司QuantStudio3仪器进行 Real-time qPCR反应。PCR反应条件为，95℃预变性2 min，然后95℃15 s，60℃ 1 min，共40个循环，建立溶解曲线。目的基因的表达相对于内参照的变化倍数用2-ΔΔCt表示，以GAPDH为内参照基因。

1.2.4 克隆形成试验 将对数生长期的贴壁肿瘤细胞用胰酶消化后稀释成细胞悬液，进行细胞计数，然后以适当的密度接种于6孔板培养皿中(约500个细胞/孔)，待细胞贴壁后加DHA或TNF-α处理24 h。2周后终止培养，PBS清洗后用多聚甲醛固定，结晶紫染色，双蒸水冲洗，晾干。计数克隆数量(>50个细胞/克隆)。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度，取20～30 g蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入一抗(Lgr5, 1∶500；p65, 1∶2 000；p-p65，1∶2 000；β-catenin，1∶2 000；Cyclin D1，1∶20 000; β-actin，1∶2 000)4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗涤3次，然后加入HRP 标记的二抗，室温孵育1 h，TBST缓冲液洗涤3次，ECL 显影。显影结果经Image J 软件分析条带灰度。以β-actin为内参，计算蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 直肠癌细胞株中Lgr5的转录和表达情况 本研究采用Real-time qPCR和Western blot法检测人直肠癌细胞系SW480、SW620、RKO和HCT116细胞中干细胞标志Lgr5的表达，结果显示，SW620细胞中Lgr5的mRNA和蛋白表达水平均相对较高(图1)。

A.Real-time qPCR法检测结直肠癌细胞中Lgr5 的基因相对转录水平；B.Lgr5 的RT-PCR半定量结果；C. Western blot法检测直肠癌细胞中Lgr5的蛋白表达。

2.2 DHA对直肠癌细胞的作用 本研究使用不同浓度的DHA(25、50、100 mol/L)分别处理直肠癌细胞SW480和SW620 24 h，采用MTT法分析DHA作用直肠癌细胞后的细胞活力，结果显示，随着DHA浓度的增加，肿瘤细胞的细胞活力明显下降，50和100 mol/L的DHA对两株直肠癌细胞的增殖具有显著的抑制效果(图2A)。克隆形成实验结果显示，DHA以剂量依赖方式抑制了直肠癌细胞的克隆形成能力(图 2B)。

A. DHA对直肠癌细胞活力的作用；B. DHA对直肠癌细胞克隆形成能力的作用。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

本研究使用0、25、50 mol/L的DHA分别处理直肠癌细胞SW480和SW620 24 h后，通过Real-time qPCR检测Lgr5及Wnt/β-catenin通路相关基因β-catenin及Survivin的转录，结果显示，50 mol/L的DHA可以抑制两株细胞Lgr5的转录(P<0.05)，可以抑制SW620细胞的β-catenin(P<0.05)及Survivin(P<0.01)的转录(图3)。

A. DHA对SW480细胞Lgr5及wnt/β-catenin通路相关基因转录的影响；B. DHA对SW620细胞Lgr5及wnt/β-catenin通路相关基因转录的影响。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 炎性微环境下DHA对直肠癌细胞Lgr5及wnt/β-catenin通路的影响 本研究以25、50 mol/L的TNF-α分别刺激直肠癌细胞株SW480和SW620 24 h，结果显示，NF-κB通路p65的磷酸化水平升高，Lgr5表达增加(图4)。25、50 mol/L的TNF-α分别使Lgr5的表达增加了2.8倍(P<0.05)和3.4倍(P<0.01)。

本研究用TNF-α(50 mol/L)和DHA(50 mol/L)分别或共同作用于直肠癌细胞，观察在炎症环境下DHA对直肠癌细胞的作用。Westernblot结果显示，TNF-α促进直肠癌细胞p65的磷酸化，上调Lgr5的表达(P<0.05)。经DHA处理后，与TNF-α组比较，TNF-α+DHA组的Lgr5表达明显下调(P<0.05)(图5)。

3 讨论

随着对肿瘤研究的深入，有学者提出，肿瘤起源于少数具有自我更新能力和多向分化潜能的肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)[6]。CSCs被认为是结肠癌发生发展的驱动细胞力量，靶向肿瘤干细胞可能是抗肿瘤治疗的重要方式[5]。近年来对结肠癌的研究已有较大进展。炎性免疫细胞亚群的功能、结直肠癌干细胞的存在、肠道菌群失衡等都是结肠癌进展的重要因素[3, 7- 8]。在慢性炎症及结肠癌微环境中，这些因素紧密联系，相互作用，共同形成了影响结肠癌发生发展的机制。

A.TNF-α对直肠癌细胞NF-κB通路的激活及Lgr5表达的影响的免疫印迹图；B～C.蛋白相对定量分析结果。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

A.免疫印迹图结果；B～C.蛋白相对定量分析结果。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与TNF-α组比较，#P<0.05。

鉴定结肠癌干细胞的潜在靶点、相关信号通路以及理解周围的微环境可能为我们提供更有效的早期诊断方法和相应的治疗方案。单纯的靶向Lgr5+结直肠癌干细胞只能达到暂时抑制肿瘤的效果，而一旦停止靶向肿瘤干细胞，周围细胞则可能通过肿瘤微环境的影响补充肠癌干细胞，使得肿瘤继续生长[4-5]。因此，找到同时具有抑制结直肠癌干细胞又有抗炎抑制炎性微环境对结肠癌细胞的去分化作用，使结直肠干细胞得不到补充的方案将会有一石二鸟的效果[9]。

DHA可以抑制乳腺癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤细胞的Wnt/β-Catenin通路[10-12]，抑制NF-κB信号通路，具有抗炎和预防肿瘤发生的作用[13-14]。SW480和SW620来源于同一直肠腺癌患者的原位肿瘤细胞(SW480)以及一年后发生淋巴结转移的肿瘤细胞(SW620)。两者都是高度恶性的直肠癌细胞，而且转移细胞瘤细胞株SW620较SW480表达更高的Lgr5。这提示，Lgr5的表达可能与肿瘤的恶性程度有关。在体外培养的条件下，炎性因子TNF-α可以激活NF-κB信号通路，促进结肠癌细胞干细胞标志蛋白Lgr5的表达。这说明，炎性微环境可能促进结肠癌干细胞的表型。DHA可以抑制结肠癌细胞增殖，抑制结肠癌细胞的克隆形成能力。Fluckiger等[15]发现，DHA可以通过促进TNF-α的自分泌的方式诱发肿瘤细胞凋亡，其机制可能是DHA促进了Foxo3a核内累积，并结合到miR-21启动子区，抑制miR-21的转录，导致结合TNF-α mRNA反应性上调，最终促进了TNF-α的表达和自分泌，诱发细胞凋亡。而本研究表明，DHA可以抑制TNF-α的转录，并在一定程度上抑制TNF-α激活的炎症信号通路，抑制wnt/β-catenin信号通路及Lgr5的表达。原因可能是因为细胞株不同，本研究的两株细胞Lgr5的表达水平也相对于HCT-116要高。此外，DHA处理的浓度差异也可能与此相关。结肠干细胞受wnt通路调节，可通过wnt通路调节Lgr5阳性干细胞的数量[16]。总之，DHA在一定程度上既可能抑制Lgr5+直肠癌干细胞，也可能抑制了直肠癌细胞的去分化，达到双重的效果。

在诱导DNA损伤后，Lgr5+干细胞对外部饮食因素(联合DHA和姜黄素)具有独特的反应，这为消除受损Lgr5+干细胞，降低肿瘤发生提供了潜在治疗策略[17]。一项meta分析纳入11项研究显示，短期服用omega-3 PUFA可降低结直肠癌术后感染并发症、炎症因子和住院时间[18]。然而，也有meta分析报道，与不含n-3 PUFAs的肠内营养相比，富含n-3 PUFAs的肠内营养对胃肠道肿瘤患者术后恢复期的营养状况、肺炎和伤口感染的发生率无显著影响[19]。本研究仅从细胞水平上探索了DHA在模拟炎性环境下对于直肠癌的作用，炎性微环境如何促进Lgr5+直肠癌CSCs的补充，DHA在体内肿瘤炎性微环境对肿瘤干细胞的具体作用及机制还需要更多系统和深入的研究。

综上所述，DHA可以抑制直肠癌细胞增殖，抑制直肠癌细胞的克隆形成能力。DHA在一定程度上抑制TNF-α激活的炎症信号通路，抑制wnt/β-catenin信号通路及Lgr5的表达。DHA具有潜在抑制Lgr5+直肠癌干细胞增殖和直肠癌细胞去分化为干细胞的双重效果。本研究为靶向直肠癌干细胞治疗方法提供新的实验证据，为临床上肿瘤的抗炎辅助治疗提供新的理论支撑。