盐碱胁迫对越橘生理特性及叶片解剖结构的影响

贾文飞，魏晓琼，聂小兰，王 颖，李金英，吴 林

(1 吉林农业大学 园艺学院，吉林 长春 130118；2 吉林省蓝莓研究中心，吉林 长春 130021)

越橘俗称蓝莓(blueberry)，是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)多年生落叶常绿灌木或小灌木，世界性小浆果树种，因果实具有独特的营养保健价值，近年来在国内外市场引起广泛的关注[1-3]。中国是潜在的越橘生产大国，自20世纪80年代引进越橘，经过几十年的推广，种植面积已经达到6.64×104hm2[4-5]。土壤盐碱化是全球性环境问题，是影响农业发展的主要因素之一，世界盐碱地约9.5亿hm2，相当于全球陆地总面积的7.23%[6-7]，而我国盐渍化面积达3.6×107hm2[8]，严重影响国内农业生产的发展，并且由于人类活动和气候变化的影响，土壤盐碱化趋势逐年加剧。国内多个越橘种植地均存在不同程度的土壤盐碱问题，其中越橘的主产区之一松嫩平原就是世界三大盐碱地之一，该地区盐碱化问题主要是由Na2CO3和NaHCO3引起的。

土壤盐碱化是影响植物生长的非生物因素之一，土壤中盐分过高会影响植物正常生长，常造成离子毒害、膜损伤、活性氧伤害、养分亏缺、生物量减少、光合作用减弱，耗能增加[9-10]，表现为叶片失绿、植株矮小、根部生长受抑。植物受到盐碱环境胁迫时会通过调整自身生理生化反应来适应，会从形态结构、原生质膜选择性吸收或排斥离子、提高植株体内水分含量、细胞渗透调节与渗透保护、离子平衡或离子区域化、活性氧清除等方面提高自身耐盐碱性[11-13]。

土壤盐碱化是目前影响越橘发展的主要限制因素之一，前人对越橘耐盐碱性研究多集中在NaCl等中性盐上[14-16]，而对碱性盐和复合盐胁迫下越橘形态生理指标的变化鲜有研究报道。本研究采用盆栽试验，从叶片形态、叶绿素含量、生理生化变化、解剖结构等方面探究越橘‘北陆’对复合盐和碱性盐环境的适应能力，旨在探明越橘的抗盐碱生理，为其在广大偏盐碱地区的种植提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

2年生半高丛越橘‘北陆’，由吉林省长春市普蓝高科技有限公司靖宇基地提供。

1.2 试验方法

盆栽试验在吉林农业大学(E120°24′，N43°48′)越橘产业化创新科研实践基地日光温室内进行。2020年5月，选取生长状况一致、无任何机械损伤和病虫害的越橘苗移栽到花盆中(盆高 30 cm、口径35 cm、底径25 cm)进行缓苗，每盆1株，栽培基质由园土和草炭二者按体积比1∶1混合而成(pH为4.8)。缓苗期共60 d。

2020年7月进行正式试验，试验采用单因素随机区组设计，在1/10改良Hoagland营养液(pH 4.8)[17]中添加不同浓度的NaCl、Na2CO3、NaHCO3进行盐碱胁迫处理，试验设复合盐(NaCl+Na2CO3)处理(A)、碱性盐(NaHCO3+Na2CO3)处理(B)两大类，A、B类处理分别设A1～A6、B1～B6处理，具体见表1。以仅浇灌1/10改良Hoagland 营养液的处理为对照(CK)。每处理3次重复，每重复3盆，共计117株越橘。

表1 不同盐碱胁迫处理的组成及溶液pH值Table 1 Composition and solution pH of different saline-alkali stress treatments

试验开始每盆越橘浇灌500 mL处理液(1/10改良Hoagland营养液与不同浓度盐碱的混合液)，为避免盐冲击将500 mL处理液分5次浇灌，每天浇灌100 mL，共浇灌5 d，若盆底托盘有溶液渗出，渗出液倒回原盆内，最后一次浇灌后的第2天记为处理1 d，每天18:00-19:00用称重法浇灌蒸馏水以弥补蒸发掉的水分。第30天，选取植株第3～5片成熟功能叶，用蒸馏水清洗干净后用滤纸擦拭表皮水分，置于密封袋中带回实验室，待测。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 叶片形态 盐碱胁迫处理30 d后，每个处理随机选取3片同一部位成熟功能叶，进行叶片形态观察。

1.3.2 叶片叶绿素含量和抗氧化生理指标 叶绿素a、b(chl a、chl b)含量采用乙醇-丙酮混合液浸泡法[18]测定，细胞膜透性(cell membrane permeability,CMP)采用电导法[18]测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光还原法[19]测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法[19]测定，可溶性糖(soluble sugar,SS)含量采用蒽酮法[19]测定，可溶性蛋白(soluble protein,SP)含量采用考马斯亮蓝法[19]测定，脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮比色法[19]测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法[19]测定。

1.3.3 叶片解剖结构 试验30 d后，在每个处理中随机取6片同一部位成熟功能叶，去掉叶柄，沿主脉将其剪成1 cm×1 cm小方块，放入FAA固定液中固定，使用真空抽滤器抽气20 min，采用常规石蜡切片技术制片[20]，使用番红-固绿染色，中性树胶封固，制成永久封片，并在35 ℃恒温保存。用Panthera i生物显微镜观察并拍照，利用Motic Images Plus 3.0(×64)软件测量叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏薄壁组织厚度、海绵薄壁组织厚度和中脉厚度，并计算叶片组织结构紧密度 (cell tense ratio,CTR) 、叶片组织结构疏松度(vein protuberant degree,SR)与栅/海(P/S):CTR=栅栏薄壁组织厚度/叶片厚度×100%，SR=海绵薄壁组织厚度/叶片厚度×100%，栅/海=栅栏薄壁组织厚度/海绵薄壁组织厚度。

1.4 数据处理与分析

使用Microsoft Excel 2016对数据进行整理，采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析和相关性分析，并用Duncan’s新复极差法检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 盐碱胁迫对越橘叶片形态的影响

由图1和表2可知，在复合盐处理(A类处理)中，当盐浓度为30～60 mmol/L时，越橘叶片形态正常；之后随着盐浓度的增加，叶片开始失绿变黄，最终出现落叶。在碱性盐处理(B类处理)中，当盐浓度为30 mmol/L时，越橘叶片形态正常；之后随着盐浓度的增加，叶片开始失绿，出现红褐色斑块，最终干枯，出现落叶。可知在高浓度复合盐和碱性盐胁迫下，越橘叶片均表现出了明显的盐害症状，且碱性盐胁迫处理叶片的盐害症状更明显。

图1 不同盐碱胁迫下越橘‘北陆’叶片形态的变化Fig.1 Leaf morphology of ‘Northland’ blueberry under different saline-alkali stress treatments

表2 不同盐碱胁迫对越橘‘北陆’叶片形态特征的影响Table 2 Effects of different saline-alkali stress treatments on morphological characteristics of leaves of ‘Northland’ blueberry

2.2 盐碱胁迫对越橘叶片叶绿素含量的影响

如表3所示，在复合盐和碱性盐处理中，随着盐浓度的增加，越橘叶片叶绿素含量均呈降低趋势。在A类处理中，除了A1处理外，其他处理的Chl a、Chl(a+b)含量与CK差异显著(P<0.05)；除A1、A2处理外，其他处理的Chl b含量与CK差异显著(P<0.05)。 B类处理中，除B1处理外，其他处理的Chl b、Chl(a+b)与CK差异显著(P<0.05)；B1～B6的Chl a含量均与CK差异显著(P<0.05)。与CK相比，A6 和B6处理的Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量降幅最大，分别下降了57.84%，52.78%，57.25%和68.62%，58.83%，65.94%。

表3 不同盐碱胁迫对越橘‘北陆’叶片叶绿素含量的影响Table 3 Effects of different saline-alkali stress treatments on chlorophyll content of ‘Northland’ blueberry mg/g

2.3 盐碱胁迫对越橘幼苗抗氧化生理指标的影响

由表4可知，随着复合盐(A类处理)和碱性盐(B类处理)盐浓度的升高，越橘‘北陆’叶片细胞膜透性呈升高趋势。在复合盐处理中，除A1、A2处理外，其他处理的细胞膜透性与CK差异显著(P<0.05)；在碱性盐处理中，除了B1处理外，其他处理的细胞膜透性与CK差异显著(P<0.05)。当盐浓度相同时，碱性盐处理的细胞膜透性高于复合盐。

由表4还可知，随着盐浓度升高，复合盐和碱性盐处理越橘‘北陆’叶片可溶性蛋白、可溶性糖、Pro、MDA含量和SOD、CAT活性均呈先增大后减小的趋势。除个别处理外，大部分盐碱胁迫处理的SP、SS、Pro、MDA含量和SOD、CAT活性与CK差异显著(P<0.05)。

表4 不同盐碱胁迫对越橘‘北陆’叶片抗氧化生理指标的影响Table 4 Effects of different saline-alkali stress treatments on antioxidant physiological indexes of ‘Northland’ blueberry leaves

2.4 盐碱胁迫对越橘叶片解剖结构的影响

由图2所示，越橘叶片由上表皮、下表皮、栅栏薄壁组织、海绵薄壁组织和中脉组成，其中栅栏薄壁组织由两层不规律的薄壁细胞组成，上、下表皮由一层排列紧密、大小不一的薄壁细胞组成。

由表5可知，复合盐处理(A处理)中，随着盐浓度的增加，越橘叶片厚度、下表皮厚度、海绵薄壁组织厚度、中脉厚度和SR总体上呈降低的趋势，上表皮厚度、栅栏薄壁组织厚度、CTR均呈先升高后降低的趋势，栅/海无明显变化规律，其中当盐浓度为90 mmol/L(A3处理)时，上表皮厚度和CTR均达到最大值。除A1处理外，其他处理各指标大多与CK差异显著(P<0.05)。

由表6可知，在碱性盐处理(B处理)中，随着盐浓度的增加，越橘叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏薄壁组织厚度、海绵薄壁组织厚度、中脉厚度和SR总体上均呈降低的趋势； CTR、栅/海均无明显变化规律，且当盐浓度为150 mmol/L(B5处理)时，二者均达最大值。除B1、B2处理外，其他处理的叶片厚度、栅栏薄壁组织厚度、中脉厚度、CTR均与CK差异显著(P<0.05)；除B1处理外，其他处理的上表皮厚度、海绵薄壁组织厚度和SR均与CK差异显著(P<0.05)；各处理下表皮厚度均与CK差异显著(P<0.05)。

图2 不同盐碱胁迫处理下越橘‘北陆’叶片解剖结构的显微观察(×100)Fig.2 Microscopic observation of leaf anatomical structure of ‘Northland’ blueberry under different salt-alkali stress treatments (×100)

表5 复合盐胁迫对越橘‘北陆’叶片解剖结构的影响Table 5 Effect of compound salt stress on anatomical structure of ‘Northland’ blueberry leaves

表5(续) Continued table 5

表6 碱性盐胁迫对越橘‘北陆’叶片解剖结构的影响Table 6 Effects of alkaline salt stress on anatomical structure of ‘Northland’ blueberry leaves

2.5 盐碱胁迫下越橘叶片各生理指标间的相关性分析

由表7可知，碱性盐胁迫处理下，越橘叶片Chl a、Chl b和Chl(a+b)与CMP均呈极显著负相关，与SP均呈极显著正相关；Chl a与Chl b和Chl(a+b)均呈极显著正相关；Chl b与CAT呈显著负相关，与Chl a呈极显著正相关；CMP与SP呈极显著负相关；SS与Pro、MDA和CAT均呈极显著正相关；Pro与MDA和CAT均呈显著正相关，与SOD呈极显著正相关；MDA与CAT呈极显著正相关。

表7 碱性盐胁迫下越橘叶片不同生理生化指标间的相关系数Table 7 Correlation coefficients of chlorophyll content and physiological and biochemical indexes of blueberry leaves under alkaline salt stress

由表8可知，复合盐胁迫处理下，CMP与SP呈显著负相关，与Chl a、Chl b和Chl(a+b)均呈极显著负相关；SP与Chl a+b呈极显著正相关；SS与Pro、SOD和CTA呈显著正相关，与MDA呈极显著正相关，与Chl(a+b)和Chl a呈显著负相关；Pro与SOD和CAT呈极显著正相关；MDA与Chl a、Chl b和Chl(a+b)呈显著负相关；SOD与CAT呈极显著正相关；Chl a、Chl b和Chl(a+b)三者之间呈极显著正相关。以上结果表明,越橘在复合盐和碱性盐环境下，叶片会通过增加体内的渗透调节物质和提高抗氧化酶活性来抵御胁迫环境，提高其对不同盐碱环境的适应能力。

表8 复合盐胁迫下越橘叶片生理生化指标间的相关系数Table 8 Correlation coefficients of chlorophyll content and physiological and biochemical indexes of blueberry leaves under compound salt stress

3 讨 论

叶片是植物的光合作用器官，其外观形态能反映植物生长状况。本试验结果表明，90 mmol/L复合盐处理越橘叶片开始失绿，而60 mmol/L碱性盐处理叶片即开始失绿，说明碱性盐对越橘‘北陆’损伤更严重，这与张晓婷等[14]的研究结果相似。

叶绿体是植物光合作用的细胞器，其中Chl a、Chl b是主要的光合色素，直接参与光合作用[21]。研究发现，NaCl胁迫下6种葡萄砧木叶片的叶绿素含量均不同程度地下降[22]。紫花苜蓿‘阿迪娜’和‘秘鲁’叶片的叶绿素含量在受到盐胁迫后显著降低[23]。本试验结果表明，与CK相比，当复合盐浓度高于90 mmol/L时，越橘叶片Chl b含量显著降低(P<0.05)；当复合盐浓度高于60 mmol/L时，Chl a和Chl(a+b)含量显著降低(P<0.05)；当碱性盐浓度高于60 mmol/L时，Chl b与Chl(a+b)含量显著降低(P<0.05)，可知复合盐和碱性盐均能使越橘叶绿素合成受阻，其中碱性盐的作用更强，这与Carter等[24]的研究结果一致。

大多数情况下，盐碱地土壤渗透压会高于植物细胞渗透压，导致植株水分外渗产生渗透胁迫，引发生理干旱，影响植株正常生长[25-26]。本研究发现，当复合盐浓度低于60 mmol/L、碱性盐浓度低于30 mmol/L时，越橘叶片的细胞膜透性均能维持正常水平，之后随着盐浓度的增大，细胞膜透性显著增加；在同一处理浓度间比较发现，碱性盐对细胞膜透性的破坏更严重，这与碱性盐土壤pH较高有关。

植物受到盐碱胁迫后体内会积累大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)，使脂膜过氧化，导致植株体内产生有毒物质MDA。本试验结果显示，与CK相比，盐碱胁迫会使越橘叶片MDA含量显著增加，其中150 mmol/L复合盐和120 mmol/L碱性盐胁迫处理的MDA含量均最大，说明复合盐和碱性盐破坏了植株正常的生理代谢系统。此外，相同盐浓度下，碱性盐处理的MDA含量总体高于复合盐处理，说明碱性盐对植株产生的伤害更强。

渗透调节是植物应对逆境胁迫的重要生理机制，盐碱胁迫时植物细胞会合成Pro、甜菜碱、糖类等有机物质来调节体内的渗透平衡[27]。研究证明，高浓度盐碱胁迫下，酸枣幼苗[28]和盐柳幼苗[29]中游离Pro会大量积累以适应盐渍环境变化。罗布麻幼苗可通过增加Pro、SS、甜菜碱等有机渗透调节物质的含量来抵御盐胁迫伤害[30]。本研究中，在2种盐胁迫处理下，越橘‘北陆’叶片的Pro、SS、SP含量随着盐浓度的升高均呈先升高后降低的趋势，且3种物质含量总体高于CK，说明越橘‘北陆’会通过增加自身渗透调节物质维持渗透平衡来抵御盐碱环境，这与前人研究结果一致。本研究中，60 mmol/L复合盐和30 mmol/L碱性盐胁迫处理下越橘叶片SP含量均达到最大值，在120 mmol/L复合盐和90 mmol/L碱性盐胁迫处理下叶片SS含量均达到最大值，在90 mmol/L复合盐和90 mmol/L碱性盐胁迫处理下叶片Pro含量均达到最大值，说明低浓度复合盐和碱性盐均能诱导越橘植株产生Pro、SS、SP来提高自身对盐碱环境的抵御能力；但当复合盐和碱性盐浓度较高时，Pro、SS、SP含量开始下降，说明高浓度复合盐和碱性盐会影响植株Pro、SS、SP合成，导致其含量降低。

植物体内存在一套完整的活性氧清除体系，用于清除胁迫环境中植株体内产生的大量活性氧，增强植物对逆境的抵抗能力，保证正常的生命活动。SOD是植物抗氧化系统的第一道防线，在逆境胁迫和衰老进程中，植物体内活性氧的产生能力大于清除能力，SOD等活性氧清除剂具有维持活性氧代谢平衡、保护膜结构的功能[31-33]。有研究发现，盐胁迫能显著提高‘大果沙枣’的SOD活性[34]。本试验结果显示，随着盐浓度的升高，越橘叶片SOD活性呈先升高后降低趋势，但总体高于CK，说明复合盐和碱性盐均会提高越橘叶片SOD活性，这与前人研究结果一致。张晓婷等[14]发现，随着NaCl浓度的增大CAT活性上升。本研究发现，随着盐浓度的增加，复合盐和碱性盐处理越橘叶片CAT活性均呈先增后减趋势，但总体均高于CK，说明复合盐和碱性盐会提高CAT活性，这与前人研究结果一致。

叶片是植物应对环境变化最敏感且可塑性较强的器官，在应对不同的生长环境时会形成不同的适应类型。盐胁迫下植物叶片内部解剖结构会发生明显的变化，因此叶片的解剖结构能反映植株对盐碱的耐受性[35-36]。本研究结果表明，在复合盐和碱性盐处理下，越橘叶片的厚度较CK明显变薄，这与Parida等[37]的研究结果一致。本研究中，在复合盐和碱性盐处理中，当盐浓度高于90 mmol/L时叶片的栅栏薄壁组织厚度显著降低(P<0.05)，当盐浓度高于60 mmol/L时叶片的海绵薄壁组织厚度显著降低(P<0.05)，说明盐碱胁迫对越橘叶片海绵薄壁组织的影响比栅栏薄壁组织更大，这与田晨霞等[38]的研究结果一致。本研究发现，在复合盐处理中，随着盐浓度的升高，越橘叶片上表皮厚度呈先增大后减小的趋势，且总体高于CK，说明在应对复合盐胁迫环境时，越橘叶片会通过增加上表皮厚度来维持叶片的正常结构。中脉在叶片中起着支持和输导的作用，是植物运输水分和同化物的重要组织。戴凌燕等[39]研究发现，苏打盐碱胁迫可显著减小甜高粱叶片厚度、中脉厚度。本研究发现，与CK相比，复合盐和碱性盐处理叶片中脉厚度均降低，这与王跃等[40]的研究一致。本研究中，与CK相比，复合盐和碱性盐处理叶片的CTR总体增大，SR总体降低，这与前人对黑枸杞[41]、海岛棉[42]、黄花草木樨[43]的研究结果一致。

植物对盐碱环境的响应是一个复杂的过程[44-45]。本研究的相关性分析结果表明，细胞膜透性与Chl a、Chl b和Chl(a+b)均呈极显著负相关关系，可能是由于一定浓度的盐碱破坏了叶片细胞膜透性，从而损害了叶绿素的合成与积累。复合盐处理下，CAT与SOD呈极显著正相关；SS与CAT、SOD呈显著正相关，Pro与CAT、SOD呈极显著正相关，SS与Pro、SOD呈显著正相关。碱性盐处理下，SS与Pro、MDA和CAT均呈极显著正相关；Pro与MDA和CAT均呈显著正相关，与SOD呈极显著正相关。结果表明，越橘会通过渗透调节系统和抗氧化系统共同抵御盐碱环境的胁迫。