萝卜肉质根糖含量相关性状的关联位点分析

高明刚，刘 镒，王瑞华，韩 敏，李媛媛

(潍坊学院 生物与农业工程学院 山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室，山东 潍坊 261061)

萝卜(Raphanussativus)是原产于我国的一种以肉质根为主要食用部位的大众化蔬菜，其营养丰富，应用广泛，可熟食、生食和加工，并具有较高的药用价值，被誉为“小人参”。萝卜肉质根中的糖含量是决定萝卜品质和商品价值的重要因子，不仅显著影响其营养品质，还与风味品质、加工品质等密切相关[1]。在萝卜选育过程中主要依赖品尝鉴评对该性状进行选择，缺乏准确性和预见性，且萝卜辣味常常掩盖甜味，造成选择结果错误[2]。因此从分子水平开展萝卜肉质根糖含量相关性状研究，并开发有效的分子标记具有非常重要的现实意义。

目前，有关植物糖含量性状机理的研究已经取得了较大的进展。Islam等[3]从柑橘中克隆了编码蔗糖合酶(sucrose synthase,SUSY)的6个基因，发现这些基因与柑橘果实的糖含量密切相关。在西瓜[4]和甜瓜[5]中的研究也发现，过表达编码液泡膜糖转运蛋白(tonoplast sugar transporter,TST)的基因能够增加果实中的可溶性糖含量。Sui等[6]通过全基因组关联分析(genome-wide association studies,GWAS)鉴定出来源于10个基因的35个SNP(single nucleotide polymorphisms)标记与大豆蔗糖含量紧密关联。Tieman等[7]基于GWAS技术在番茄9号和11号染色体中检测到2个与葡萄糖和果糖含量显著关联的位点，并对位于9号染色体的位点进行深入分析，发现位于Lin5基因366位的SNP位点突变，由天冬酰胺(Asn)突变为天冬氨酸(Asp)，且突变植株中糖含量更高。

相对于其他植物，萝卜肉质根糖含量的研究进展则严重滞后，目前仍主要集中在不同条件下糖含量的变化[8-11]、最适遗传模型[1,12]等研究。本试验以134份萝卜品种为研究材料，分别于2015-2017年在山东潍坊种植，在收获期对其肉质根的果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性总糖含量和甜度值进行分析，利用SSR标记进行全基因组关联分析，检测与萝卜肉质根糖含量性状显著关联的位点，以期为萝卜品质改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用来自不同地区的萝卜品种共134份，作为自然群体。其中，北京品种34份，山东品种25份，湖北品种11份，广东品种8份，河北品种6份，吉林、江苏、天津和浙江品种各5份，辽宁品种4份，河南、重庆、四川品种各3份，沈阳品种2份，江西、福建、安徽品种各1份，外国品种12份(表1)。134份萝卜品种于2015年、2016年和2017年连续3年种植在山东潍坊寒亭区试验场。每年8月中旬播种，待萝卜肉质根成熟时，每个品种取3个萝卜，洗净擦干后，切取肉质根中间部分进行混合取样。样品贮藏于-20 ℃备测。

表1 供试的134份萝卜品种Table 1 A total of 134 radish varieties used in this study

表1(续) Continued table 1

表1(续) Continued table 1

1.2 糖含量测定

采用高效液相色谱(HPLC)法测定萝卜肉质根中的蔗糖、果糖和葡萄糖含量。糖提取和HPLC测定步骤参照李媛媛等[13]的方法。可溶性总糖含量(total sugar content,TS)=果糖+葡萄糖+蔗糖[14]。甜度值(sweetness index,SI)=蔗糖含量×1.00+果糖含量×1.75+葡萄糖含量×0.70[15]。

1.3 表型数据统计分析

利用SPSS 20.0软件对134份萝卜品种的5个糖含量性状(蔗糖、果糖、葡萄糖、TS和SI)进行正态性检验、方差分析和相关性分析。各性状的广义遗传力根据公式HB2=σg2/(σg2+σe2)计算，其中HB2表示广义遗传力，σg2表示遗传方差，σe2表示环境方差[16]。

1.4 SSR标记分析

采用CTAB小样法[17]提取萝卜叶片DNA。SSR引物预筛选用1.2%琼脂糖，SSR引物垂直电泳筛选和群体扩增检测用6%聚丙烯酰胺凝胶，显色方法为银染法。本试验所选用的400对SSR引物均来源于公开发表的文献[18-22]。引物序列由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。

SSR产物群体扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果统计采用“0，1”法，有条带为“1”，无条带为“0”。同一个引物扩增产物在材料中的不同位点，按照条带长度由大到小分别记为“a”、“b”、“c”等。利用PowerMarker V3.25软件[23]对SSR分子标记数据进行多态性分析，计算基因多样性指数与多态性信息含量(polymorphism information content,PIC)。

1.5 群体结构分析和关联分析

基于获得的SSR分子标记数据，利用Structure 2.3.4软件[24]进行群体结构分析。将起始不作数迭代和不作数迭代后的MCMC分别设置为50 000和500 000次，类群数K设置为1～10，重复5次，以获取材料相应的Q矩阵。然后根据Evanno等[25]的方法确定群体的最佳K值。

利用Spagedi程序[26]计算134份萝卜品种的Kinship矩阵。将得到的Q矩阵和Kinship矩阵作为协变量，利用Tassel 3.0软件[27]的混合线性模型(MLM)对标记与所测性状进行关联分析，P≤0.01认为标记与性状存在显著关联。

1.6 电子定位

根据SSR引物序列，利用Primer-BLAST在线程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与萝卜基因组序列进行序列比对，获取各标记位点在基因组上的定位信息。

2 结果与分析

2.1 134份萝卜品种肉质根中的糖含量分析

分别于2015―2017年连续3年田间种植134份萝卜品种，利用HPLC法测定成熟萝卜肉质根中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量，计算萝卜肉质根中可溶性总糖含量和甜度值，同时根据不同年份间的数据，对以上5个性状的基因型方差、环境方差、变异系数和广义遗传力进行计算，结果如表2所示。表2表明，连续3年内5个糖含量相关性状及其平均值都呈现出了较大的变异，变异均达到极显著水平(P≤0.01)。各个性状的广义遗传力为30.67%～60.10%，其中甜度值的广义遗传力最高(60.10%)，其次为葡萄糖(53.79%)、可溶性总糖(48.51%)和果糖(40.73%)，而蔗糖的广义遗传力最小，仅为30.67%。

相关性分析发现，除果糖与蔗糖为显著正相关外(P≤0.05)，其他性状之间都表现出极显著正相关关系(P≤0.01)(表3)，表明各种糖含量相关性状间存在互相联系，某种程度上可能存在相同或相似的调控基因。

表2 134份萝卜品种肉质根中糖含量相关性状表型数据Table 2 Statistics of phenotypic traits for sugar variables in 134 radish varieties

表3 134份萝卜品种肉质根中5个糖含量性状间的相关性Table 3 Correlation coefficients among five sugar variables in 134 radish varieties

2.2 134份萝卜品种的SSR标记分析

根据公开发表的SSR标记信息，设计合成400对SSR引物。经过琼脂糖凝胶电泳初步检测，得到能扩增出清晰条带的199对SSR引物；再对199对SSR引物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最终选用了重复性好、条带清晰的156对SSR引物。再用156对SSR引物对134份萝卜材料进行扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测获得了349个多态性标记。图1给出了部分标记琼脂糖凝胶电泳筛选、聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选及群体扩增结果。

对获得的349个多态性标记进行统计分析，平均每对引物扩增得到2.237个等位变异，变异值为1～4个。SSR引物的PIC为0.106～0.864，平均为0.498；基因多样性指数为0.112～0.877，平均值为0.542(图2)。

A.琼脂糖凝胶电泳筛选的部分标记；B.聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选的部分标记；C.引物PR039在部分材料中的扩增检测。a，b.表型差异大的2份材料；1～44.包含134份萝卜品种的自然群体中的部分材料；M.分子量标准A.Screening of partial markers by agarose gel electrophoresis;B.Screening of partial markers by PAGE electrophoresis; C.PCR products electrophoresis of marker PR039 in partial varieties.a,b.Varieties with extremely different phenotypic traits；1-44.Partial of 134 cultivars in radish natural population;M.Marker

图2 156对SSR标记的基因多样性(A)与多态性信息含量(B)频数分布图Fig.2 Gene diversity (A) and PIC frequency (B) profiles of 156 SSR markers

2.3 134份萝卜品种的群体结构分析

利用软件Structure 2.3.4对134个萝卜品种的群体结构进行分析。模拟类群数设为K，当K=1～10时，ΔK在K=2时出现最高峰(图3-A)，因此将这些萝卜材料划分为2个亚群(Pop1和Pop2)，群体结构图如图3-B所示。其中亚群1(Pop1)包含46个萝卜品种，对应表1中1～46号品种；亚群2(Pop2)包含88个萝卜品种，对应表1中47～134号品种，且亚群分类与地理来源无明显对应关系。

图3 134 份萝卜品种的K值与ΔK值变化图(A)和群体结构图(B)Fig.3 Magnitude of ΔK as a function of K (A) and population structure (B) for 134 radish varieties

2.4 SSR标记与萝卜品种糖含量性状的关联分析

基于混合线性模型MLM(Q+K)，利用获得的349个多态性标记对2015-2017年3年内134份萝卜肉质根糖含量相关性状及其3年平均值进行关联分析。结果(表4)发现，5个糖含量相关性状共关联到61个位点，其中与葡萄糖含量关联的位点最多，达16个；与果糖含量关联的位点最少，为9个。单个关联标记位点解释的表型变异值为5.19%～16.29%。

由表4可见，与果糖含量关联的位点有9个，2015年关联3个，2016年关联1个，2017年关联2个，3年平均值关联5个，其中标记NRSr_417b在2017年和3年平均值中能同时被检测到，标记PR015a在2015年和3年平均值中也能同时被检测到。与葡萄糖含量关联的位点有16个，2015年关联7个，2017年关联5个，3年平均值关联4个，但在2016年未检测到关联标记，且没有1个标记能够被重复检测到。与蔗糖含量关联的位点有13个，2015年关联6个，2016年关联1个，2017年关联4个，3年平均值关联9个，其中标记NRSr_730b在2015年、2017年和平均值中能同时被检测到，NRSr_767a、NRSr_71d和NRSr_230b 3个标记在2017年和平均值中能同时被检测到，NRSr_240c和NRSr_389a 2个标记在2015年和平均值中能同时被检测到。与可溶性总糖含量关联的位点有10个，2015年检测到4个，2017年检测到5个，平均值检测到1个，而2016年未检测到关联位点，且没有1个关联位点能够被重复检测到。与甜度值关联的位点有13个，其中2015年检测到4个关联位点，2016年检测到1个关联位点，2017年检测到5个关联位点，平均值检测到4个关联位点，标记NRSr_417b在2017年和平均值中能同时被检测到。

表4 134份萝卜品种糖含量性状显著相关的SSR位点Table 4 Loci associated with sugar variables of 134 varieties

表4(续) Continued table 4

此外，本研究中还发现14个分子标记具有“一因多效”现象(表5)。如标记NRSr_292能同时与果糖、葡萄糖、可溶性总糖含量及甜度值4个性状关联，标记NRSr_71d和NRSr_730b能同时与葡萄糖、蔗糖、可溶性总糖含量及甜度值相关联。

表5 与糖含量性状显著相关的“一因多效”标记信息Table 5 Pleiotropic markers associated with sugar variables

3 讨论与结论

前人研究表明，许多植物的糖含量相关性状是典型的数量性状，由多个基因控制[28-31]。本研究也发现，不同萝卜材料中蔗糖、果糖、葡萄糖、TS和SI都表现出连续性变化趋势，基本符合正态分布，因此认为萝卜肉质根中这5个糖含量相关性状也是数量性状，是由多个基因共同作用的。糖含量相关性状的遗传力研究是对其进行遗传改良的基础，此类研究受到了国内外学者的广泛关注[30-33]。本研究发现，蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性总糖(TS)和甜度值(SI)的广义遗传力(HB2)分别为30.67%，40.73%，53.79%，48.51%和60.10%。这与任喜波等[12]在萝卜中的研究结果(可溶性糖、果糖和蔗糖的HB2分别为44.29%，50.08%和47.24%)相近。以上结果表明，萝卜中糖含量相关性状是典型的数量性状，虽受环境影响较大，但也有较强的遗传效应。

关联分析是从分子水平研究数量性状的主要方法之一。目前，该方法已应用于植物糖含量相关性状机理研究。如Ferro等[34]利用80 591个SNPs标记进行GWAS分析，发现有3个标记与四倍体蓝莓的可溶性固形物含量密切相关。Fickett等[31]研究发现56个标记与甘蔗糖含量相关性状紧密关联。Sui等[6]通过GWAS分析鉴定出了来源于10个基因的35个SNP标记与大豆蔗糖含量紧密关联。Tieman等[7]在9号和11号染色体中检测到2个与番茄葡萄糖和果糖含量显著关联的位点。

本研究利用SSR标记对萝卜肉质根5个糖含量相关性状进行了关联分析，共关联到61个位点。单个关联标记位点的贡献率为5.19%～16.29%，绝大多数位点的贡献率在10%以下。这可能是因为该位点本身为微效等位基因所致，也可能是因为该位点并非真正的目标位点，而只是与目标位点处于同一LD水平[35]。此外，也有研究表明，在自然群体中检测到的单个效应值会相对偏小[36]。

在与葡萄糖关联的位点中，NRSr_663b标记是一个EST-SSR标记，经过电子定位，发现其位于基因ERD6-like4(sugar transporter ERD6-like4)中。ERD6-like是一类单糖转运子[37]。Yamada等[38]推测，该类基因可能具有通过与植物细胞中的液泡转化酶协同反应来调节糖的再分配和细胞渗透压的作用。Zhang等[39]研究认为，BnERD6-like14可能参与了油菜中库器官的糖卸载过程。本研究中，ERD6-like4(NRSr_663b)是葡萄糖3年平均值的关联位点，可以解释变异率的5.38%。推测该基因可能参与了萝卜肉质根中葡萄糖含量的形成。

Fickett等[31]研究发现，与甘蔗糖含量相关性状关联的SNP标记中，大多数标记存在“一因多效”现象。本研究发现，糖含量相关性状之间存在明显的相关关系，在遗传基础上也存在“一因多效”，如位于3号染色体的NRSr_292标记同时与果糖、葡萄糖、可溶性总糖、甜度值密切相关；分别位于4号和9号染色体的NRSr_71d和NRSr_730b，也都与葡萄糖、蔗糖、可溶性总糖和甜度值关联。该结果表明，萝卜肉质根糖含量相关性状之间存在一定的遗传相关性。

本研究中，仅有1个与蔗糖含量相关的标记(NRSr_730b)能够在不同年份中被检测到。这表明萝卜糖含量性状的分子机理具有很大的复杂性，环境和基因型的互作可能对糖含量相关性状影响较大，且这些关联位点的检测与环境条件和试验条件密切相关。

综上，本研究在包含134份萝卜品种的自然群体中，利用349个SSR标记对萝卜肉质根果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性总糖含量和甜度值进行了GWAS分析。在P≤0.01阈值下共获得了61个关联位点，单个位点贡献率为5.19%～16.29%，其中有14个关联位点存在“一因多效”现象。