Coffin-Siris 综合征3 例患儿的临床表型分析和基因诊断研究

吴臣臣 张惠文

上海交通大学医学院附属新华医院 上海市儿科医学研究所内分泌遗传代谢科（上海 200092）

Coffin-Siris 综合征（Coffin-Siris syndrome，CSS），是一种罕见的常染色体显性遗传病，包括1～11种亚型，分别由ARID1B、ARID1A、SMARCB1、SMARCA4、SMARCE1、ARID2、DPF2、SMARCC2、SOX11、SOX4、SMARCD1基因变异引起，这些基因主要编码BAF（BRG1-associated factor）染色质重塑复合体[1-3]。此外，有研究发现SMARCA2、PHF6基因的致病性变异也可能与CSS有关[4]。

CSS 的临床表型多样，典型的临床表现为生长发育迟缓，特殊面容（面容粗糙、鼻梁低、发际线毛发旺盛、浓眉、睫毛长、唇毛多、嘴唇厚），多毛症，肌张力低下，第五指/趾发育不全等，可合并有胼胝体发育不良[5]，容易误诊为其他遗传代谢性疾病，如线粒体病和溶酶体贮积病。

临床上，全外显子组测序技术（whole-exome sequencing，WES）被广泛应用于疾病的基因诊断。据报道，家系全外显子组测序（trio-WES）的基因诊断率约为40.0%，先证者模式WES的基因诊断率为28.0%，仍有较多罕见疾病未得到确诊[6]。全基因组测序分析（whole-genome sequencing，WGS）是一种基于全基因组分析的测序技术，可提高疾病的诊断率[7]。本文拟采用染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）、trio-WES分析、trio-WGS分析、一代测序等多种基因检测方法对3例基因诊断未明的CSS 患儿进行基因诊断研究，明确其致病原因，为临床诊断和遗传咨询提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2018年—2021年就诊于上海交通大学附属新华医院儿童罕见病与疑难杂症门诊的3例确诊为Coffin-Siris综合征患儿的临床资料。

1.2 方法

1.2.1 临床表型及各项常规辅助检查 分析患儿临床表型，并完善患儿血常规、尿常规、血液生化、乳酸、血氨、甲状腺功能等检查，完善血氨基酸、脂酰肉碱谱及尿有机酸检测，完善溶酶体酶学测定，完善心电图、脑电图、腹部及心脏超声检查，完善头颅MRI检查。

1.2.2 外周血基因组DNA 提取 经家长同意，应用EDTA 抗凝管抽取患儿及家长外周静脉血2 mL，采用全基因组DNA提取试剂盒（美国OMEGA公司）提取DNA。

1.2.3 CMA 使用Affymetrix公司标记检测试剂盒以及推荐的相关厂家产品，采用Cytoscan®750K芯片检测患儿全基因组范围的拷贝数变异（copy number variations，CNV），芯片产生的原始数据使用Affymetrix公司染色体分析套件（ChAs）1.2.2软件进行结果分析。

1.2.4 Trio-WES检测 样本中提取的DNA经过片段化及文库制备，用探针捕获目标基因的外显子及邻近区域，经高通量测序平台HiSeq 2500（Illumina，美国）进行测序。对原始数据进行过滤，得到高质量的测序结果进行分析。

1.2.5 Trio-WGS 检测 对CMA 和WES 均未找到致病变异的患儿进行WGS 分析。从样本中提取200 ng 基因组DNA，用Covaris S 220 超声聚焦仪（Covaris，美国）进行剪切，随后进行文库构建。建库完成后，在MGISEQ-2000平台（MGI，武汉）上对每个样品进行双向测序，最小读取深度为40X[8]。

1.2.6 Sanger测序验证 针对SMARCB1、ARID1B基因致病位点设计引物（表1）并检测引物的特异性。目标序列PCR扩增后产物经ABI3730测序仪进行正反向测序，同时对父母进行验证。

表1 Coffin-Siris 综合征SMARCB1和ARID1B基因变异位点引物

1.2.7 致病基因变异位点分析 应用dbSNP、ExAC、千人基因组数据库、HGMD 和PubMed 等公共数据库对目标变异位点进行检索，判断是否为新变异。参考美国医学遗传学与基因组学学会（American college of medical genetics and genomics，ACMG）指南对变异位点进行致病性分析[9]。

1.2.8 外周血建立永生化淋巴细胞系和蛋白免疫印迹法 为检测患儿3ARID 1 B基因第11 号外显子（e 11）的部分缺失对蛋白表达的影响，采集患儿3 的外周血，并根据文献报道方法构建EB 病毒感染的永生化淋巴细胞系[10]。蛋白免疫印迹法用于检测ARID 1 B 蛋白的表达，所用抗体如下：小鼠单克隆抗 ARID1B（Abcam，1:1000）和兔抗 β-actin（碧云天，1:1000）。

2 结果

2.1 患儿临床表型及各项常规辅助检查结果

患儿1，男，3 月22 天，因“孕中晚期发现发育迟缓至今”于2021年2月19日就诊。患儿系G1P1，足月顺产，出生身长47.0 cm，出生体质量2.3 kg，Apgar评分不详，无缺氧窒息史。其母否认妊娠期间化学品、毒物和放射线接触史。孕中晚期外院检查发现胎儿较小，胎儿头颅MRI 示透明隔未见。患儿出生后吃奶尚可，身长、体质量增长慢。查体：身长60.2 cm（-1.9 SDS），体质量5.6kg（-2.3 SDS），头围41.5 cm，脸小，前囟1.5 cm×1.5 cm，腭裂2度，脊柱无侧弯，体毛正常，无蒙古斑。抬头90度，双手握拳，双下肢肌张力稍高。患儿父母无异常，否认近亲婚配。

患儿2，男，1 岁2 月龄，因“自幼发育迟缓”于2021年1月25日就诊。患儿系G2P1，足月剖腹产，出生身长50.0 cm，出生体质量不详，Apgar评分不详，家长诉患儿出生时有缺氧窒息史。其母否认妊娠期间化学品、毒物和放射线接触史，孕期产检正常。家长诉患儿生长发育稍落后于同龄儿童，6 个月会翻身，现不会独走，可扶走、独站片刻。目前有无意识发音，不会叫人，可认物，偶可按指令做简单动作。查体：身长77.2 cm（-0.5 SDS），体质量9.7 kg（-0.7 SDS），有喉软骨发育不良。全身毛发旺盛，面部双眼睑下斜，背部无蒙古斑，无脊柱侧凸，肝脾未及明显肿大。

患儿3，女，2 岁8 月龄，因“自幼发育迟缓”于2018年4月16日就诊。患儿系G1P1，足月顺产，出生身长50.0cm，出生体质量4.0kg，否认出生时缺氧窒息史。其母否认妊娠期间化学品、毒物和放射线接触史，孕期产检正常。患儿出生后生长发育落后于同龄儿童，1岁时Gesell评分68～75分，不能独站。目前尚不会说话，走路不稳。无癫痫发作，视力和听力可。查体：身长91.0 cm（-0.6 SDS），体质量15.0 kg（+1.1 SDS）；面容眉毛重，睫毛长，嘴唇厚，舌偏大，双眼睑下斜，双手第五指稍弯曲，指垫明显。四肢和背部毛发旺盛。皮肤无色素沉着，心肺腹部无异常，外生殖器无异常。

患儿2胰岛素样生长因子（IGF-1）43.1 ng/mL，低于正常值低限（51～303ng/mL）。3例患儿实验室检查与临床特点见表2。

表2 3例患儿实验室检查及临床特点

2.2 CMA分析结果

未检测到明确的致病性微缺失或微重复。

2.3 Trio-WES和Sanger测序明确患儿1和患儿2致病变异

Trio-WES 提示患儿1 携带1 个SMARCB 1基因（NM_003073.3）杂合剪切变异c.363-3C＞G。对该患儿及其父母目标序列进行Sanger测序验证，确认该患儿SMARCB1基因存在该变异，父母均不携带该变异，为新发变异。患儿2ARID1B基因（NM_020732）存在一个杂合剪切变异c.3550+1(IVS 13)G＞A，同样经过对患儿2及其父母目标序列进行Sanger验证，结果显示该患儿ARID 1 B基因存在该变异，父母均为野生型，属于新发变异。两例患儿及其父母Sanger测序峰图见图1。

图1 患儿1、2 及其父母Sanger 测序图

2.4 Trio-WGS分析和Sanger测序明确患儿3致病变异

WGS提示患儿3ARID1B基因（NM_020732.3）存在杂合性e11部分（chr6:157495236-157495405）缺失。对患儿及其父母目标序列进行Sanger测序验证，结果显示该患儿ARID1B基因存在该片段缺失，父母均不携带该变异，属于新发变异（图2A）。

图2 患儿3 Sanger 测序图和蛋白免疫印迹结果

2.5 变异致病性分析

根据ACMG 遗传变异分类指南评级规则，对3例患儿进行变异致病性分析。

患儿1SMARCB 1基因变异位点c.363-3 C＞G分析：①为新发突变（强致病性证据PS2，父母验证为野生型）；②比对千人基因组数据库、HGMD等未见变异报道和收录（中等致病性证据PM2）；③多种生物信息学软件预测为有害（支持性证据，PP3）。此变异评定为“可疑致病”（PS2+PM2+PP3）。

患儿2ARID1B基因变异位点c.3550+1(IVS13)G＞A 分析：①LOF 变异导致基因功能可能丧失（超强致病证据PVS 1）；②新发变异（强致病性证据PS 2，该变异经双亲验证为新生变异）；③比对千人数据库、EXAC 数据库中正常对照人群中未发现的变异（中等致病性证据PM2）；④多种生物信息学软件预测为有害（支持性证据，PP3）。此变异评定为“致病”（PVS1+PS2+PM2+PP3）。

患儿3ARID1B基因CNV分析：①LOF变异导致基因功能可能丧失（超强致病证据PVS 1）；②新发变异（强致病性证据PS2，该变异经双亲验证为新生变异）；③比对千人数据库、EXAC 数据库中正常对照人群中未发现的变异（中等致病性证据PM2）。此变异评定为“致病”（PVS1+PS2+PM2）。

结合临床表现和靶向测序的结果，3例患儿均诊断为Coffin-Siris综合征，其基因变异位点和致病性分析见表3。

表3 3例患儿的基因变异及致病性分析

2.6 患儿3 ARID1B蛋白表达

为进一步证明患儿3 的ARID 1 B基因拷贝数缺失为致病性变异，通过蛋白免疫印迹法检测ARID1B蛋白的表达量。如图2B所示，患者3 外周血淋巴细胞ARID 1 B 蛋白表达水平明显低于正常对照。

3 讨论

本文的研究对象均因“发育迟缓”来院就诊。询问相关病史，结合相关临床表现，我们考虑可能为CSS。目前CSS 尚无明确的发病率报道，国外报道200余例且发现男女发病率无明显差异[11]，中国人群中仅有散在病例报道[12-14]。CSS临床表型多样，尚无统一的临床诊断标准；生长发育迟缓、特殊面容合并多系统异常表现，对临床诊断具有重要价值，但要明确其致病性变异，需结合基因诊断的结果。CSS致病基因的发现集中在近10年，临床医生可能对此病认识不足，容易出现延迟诊断和误诊。

CMA 和WES 技术是近些年进行疾病致病基因检测的主要工具。CMA 和WES 技术的阳性检出率都取决于探针的设计，因此它们对新发和罕见变异位点的检出率较低[15]。WGS是一种更有应用前景的测序技术，可检测基因外显子及内含子区变异（包括点变异、20bp以内插入缺失）和染色体非整倍体变异，对CNV、结构变异、线粒体DNA变异、单核苷酸变异和插入缺失的检出率要高于CMA 和WES，有文献报道，WGS阳性率可高达50.0%[7]。本文结合病例的实际情况，采用多种基因诊断技术对3 例疑似CSS患儿进行病因学研究。

本研究中，3 例患儿CMA 结果均为阴性。采用trio-WES分析，发现患儿1为SMARCB1基因新发剪切变异，患儿2为ARID1B基因新发剪切变异。通过CMA和WES检测，患儿3仍未找到明确的致病位点，为进一步明确基因诊断，对患儿3 及其家长进行家系WGS。结果显示，患儿3的ARID1B基因存在e11的部分缺失，Sanger验证发现父母均为野生型。

SMARCB1基因变异与CSS3型（MIM:614608）有关，该病主要临床表现为宫内发育迟缓，矮小，小头畸形，长睫毛，脊柱侧凸，末节指（趾）骨发育不良或缺失，多毛，智力障碍，发育落后，胼胝体异常等[16]，患儿1的临床表现与文献报道的临床表现相符，主要出现了孕中晚期的发育迟缓，脑发育不良以及出生后发育迟缓。另外，该患儿有双下肢肌张力的异常表现，临床要注意定期随访，及早进行康复治疗干预。本研究中该患儿SMARCB 1基因的新生剪切变异c.363-3C＞G，为国际上未报道的变异位点，丰富了SMARCB1基因突变谱。

ARID 1 B基因变异是CSS 患者中变异频率最高的基因，与CSS1型（MIM:135900）有关，主要临床表现为面容粗，鼻尖钝，睑裂下斜，睫毛长，眉毛浓密，多毛症，手指垫突显，智力障碍，发育迟缓，身材矮小，语言发育落后，胼胝体发育不全，合并反复呼吸道感染，第五手指远端指骨短小等[17]。患儿2 和患儿3 均出现了发育落后，多毛症及面部双眼睑下斜的异常体征。患儿2 的独特表现为反复上呼吸道感染，患儿3的独特表现为面部和手指的异常体征，以及语言发育落后，两例患儿均未出现头颅MRI 的异常，与文献报道的ARID 1 B基因变异临床表现基本相符[17]。本研究中，患儿2ARID1B基因存在新生剪切变异c.3550+1(IVS13)G＞A，患儿3ARID1B基因存在新生CNV（e11del），两个位点均为未报道的变异位点，丰富了ARID1B基因变异谱。有报道指出ARID1B基因的微缺失在其疾病谱中起着重要的作用，占比高达10%，对ARID 1 B基因进行CNV 检测和分析可提高该基因变异的检出率和CSS阳性确诊率[18]。患儿3 的基因诊断经历了漫长的过程，最终通过trio-WGS分析确定了其致病基因变异位点，为WGS在CSS诊断中的作用提供了科学依据。此外，还有研究表明，ARID 1 B基因变异是导致智力落后的重要原因之一，约占0.9%[19]，因此，当临床上有不明原因智力落后的患儿就诊时，临床医生需要考虑到该基因的变异，如遇到CMA 和WES 均无法确诊时，应考虑WGS的尽早应用。

目前，CSS患者尚无有效的治疗方法，主要是对症支持治疗，如康复治疗、生长激素治疗，同时预防心脏、胃肠、神经等系统的并发症[20]。本组报道的3例患儿基因变异均为未报道过的新发变异，进一步扩展了CSS 的遗传谱。由于本研究仅报道3 例CSS患儿，存在一定的局限性。当临床工作中遇到存在疑似CSS临床表型患儿，建议尽早行WES以明确诊断，如果诊断仍未明，可行WGS 以明确基因诊断，为后续治疗及遗传咨询提供确诊性依据。