应用iTRAQ技术分析铵态氮胁迫对杨树根系蛋白质组学的影响1)

王红玲 黄瑞芳 施士争

(江苏省林业科学研究院，南京，211153)

随着社会经济发展，来自工业、农业及市政的污水排放量不断增加，大量营养元素被释放到环境中。过量营养元素，尤其是氮和磷，加速地表水体富营养化过程，造成水环境污染，已成为全球最关注的水环境问题之一。近些年中国环境状况公报显示，河湖富营养化已成为我国水环境的普遍现象，七大水系总体为重度污染，且都存在铵态氮指标过高的问题[1-2]。目前，控制水体富营养化的研究快速发展，其中植物修复技术对富营养化水体的治理起到重要作用，一些具备生长快速且有高效去除养分能力等特性的水生植物是研究的重点，其建设运营成本低，非常适合中国国情[3-4]。

杨树(Populusspp.)是一种重要的造林树种，其生长快、应用范围广，广泛栽植于我国东北和西北部地区。由于杨树生长快，所需水分与养分较多，其根系深且庞大，可以持续不断地从土壤中吸收水分与硝态氮、铵态氮等污染物，而且杨树的根系活力高，可以蒸发大量水分并吸收土壤中的污染物，这些污染物被杨树吸收净化的同时，能够促进杨树的生长。因此，杨树具备高生物量、高蒸发量和对营养元素的高效吸收，被称为富营养化水体修复的有效植物材料[5-6]。此外杨树具备遗传多样性、无性繁殖方便、基因组小、分子生物学手段可适性等特点，是林木研究的模式植物[7-8]。南林3412杨(Populusdeltiodescv.“3412”)是南京林业大学培育的“不飘絮”雄性速生美洲黑杨新品种，具有速生、适应性强、生长势强劲等优点[9]。目前关于南林3412杨响应铵态氮胁迫的机理研究还鲜有报道。

蛋白质组学是一项系统分析生物体内蛋白质表达变化和规律的方法学[10]。蛋白质组学的研究方法主要包括双向凝胶电泳(2-DE)技术、同位素标记的相对和绝对定量(iTRAQ)技术、双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术和同位素亲和标签(ICAT)技术等[11-12]。近些年来，蛋白质组学和生物信息学相结合，被广泛应用于研究盐胁迫和铵态氮胁迫等逆境胁迫下植物的响应机理[13]，包括水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、黄瓜(Cucumissativus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、紫花苜蓿(Medicagosativa)和番茄(Solanumlycopersicum)等[14-18]。Cheng et al.[15]利用蛋白组学技术鉴定到18个水稻蛋白在盐胁迫下差异表达，其中大多数为膜相关蛋白，参与膜稳定、离子平衡和信号转导等过程，并鉴定到一个富含亮氨酸的受体激酶(OsRPK1)是盐胁迫响应蛋白。Xun et al.[19]通过蛋白组学技术发现在铵态氮胁迫下，番茄体内参与氨同化的蛋白表达量上调，细胞壁代谢相关蛋白的表达量也发生了改变，导致番茄生长受到抑制。上述这些研究说明蛋白质组学可以解析植物在受到逆境胁迫后的蛋白质表达变化，进而帮助深入了解植物应对逆境胁迫的代谢和调控机理。

本研究通过iTRAQ标记定量蛋白质组学技术，对低质量浓度和高质量浓度铵态氮胁迫处理下的杨树苗根系的整体蛋白质表达变化进行分析，并进一步分析差异蛋白涉及的生物学功能，旨在深入揭示其响应铵态氮胁迫的机理，为将来杨树的抗逆栽培技术及富营养化水体修复的应用提供数据支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

本试验选取杨树“南林3412杨”无菌苗，在江苏省林业科学研究院的温室中进行充氧水培，水培盒容积为10 L，初始水培溶液为1/8 Hogland营养液，培养温度为(10～25)℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为06:00—18:00。水培20 d后，水培苗株高达15～20 cm，挑选其中生长一致的水培苗开始胁迫处理。设置3种处理方式：低质量浓度(2 mg/L NH4Cl溶液)铵态氮胁迫、高质量浓度(20 mg/L NH4Cl溶液)铵态氮胁迫和对照(无铵态氮胁迫)，在3种处理中分别放入10株水培苗，设置3个重复。每周更换一次培养液，培养5周后同时收割不同处理下的水培苗根部，液氮保存。

1.2 药品与试剂

本试验用到的药品和试剂为：3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、IPG Buffer、甲酸铵，均购自GE公司；尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羧基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、三氯乙酸(TCA)、碳酸钠、过硫酸铵(APS)、四甲基二乙胺(TEMED)，均购自Amresco公司；甲酸(Formic acid)、碘乙酰胺(Iodacetamide,IAA)、蛋白酶抑制剂(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)，均购自Sigma公司；胰蛋白酶(Trypsin Gold)购自Promega公司；乙腈(CAN)、色谱水等购自Thermo Fish公司；iTRAQ 8 plex试剂盒(SCIEX)；Tris-HCl(pH=6.8、8.5、8.8)、考马斯亮蓝G-250、溴酚蓝(Bromophenol blue)、丙酮、甲醇、乙醇、Bradford蛋白质量浓度测定试剂盒；其它试剂均为国产分析纯。

1.3 实验仪器

本试验用到的主要仪器设备为：冷冻离心机(Eppendorf)；分光光度仪(Evolution 200，赛默飞世尔科技)；超纯水装置(密理博公司)；真空冷冻干燥机(Thermo)；水浴锅；天平；Eksigent nanoLC-UltraTM2D系统(SCIEX)；分析型液相色谱Agilent 1200(Agilent)；TripleTOF 5600系统(SCIEX)；Protein Pilot 5.0软件(SCIEX)；涡旋振荡器。

1.4 蛋白质提取

将3种处理下取得的杨树水培苗根系组织用超纯水冲洗干净、纸巾轻轻擦干，采用TCA-丙酮法提取蛋白，大致步骤如下：用液氮将样品研磨成粉末，用充分预冷的体积分数10% TCA-丙酮溶液(含0.1% DTT和1 mmol/L PMSF)溶解，-20 ℃沉淀过夜；离心(15 000 r/min，4 ℃，20 min)、弃上清；沉淀物用丙酮溶液(含0.1% DTT和1 mmol/L PMSF)溶解，-20 ℃静置2 h后，离心(15 000 r/min，4 ℃，20 min)、弃上清，重复本步骤2次；沉淀物冷冻干燥成粉末后，用裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF、0.5%载体两性电解质)充分溶解；离心(15 000 r/min，4 ℃，20 min)取上清(3次)。采用Bradford法蛋白质质量浓度测定试剂盒测定蛋白质量浓度。

1.5 ITRAQ标记试验

根据ITRAQ试剂盒配套说明书进行标记定量试验，大致步骤：8份(对照取2份、低质量浓度和高质量浓度铵态氮胁迫处理各取3份)样品均取100 μg蛋白，按试剂盒配套方法进行蛋白质还原、烷基化修饰，再按照m(酶)∶m(蛋白)=1∶40的比例向各份样品中加入胰蛋白酶，37 ℃酶解过夜(14 h)，得到肽段后，进行标记。标记物与肽段充分反应(2 h)，再用超纯水中止(0.5 h)。然后将所有标记后的混合到一起，充分混匀后冷冻干燥成粉末，等待液相色谱—质谱检测平台上机检测。

1.6 高pH-RP液相分离

冷冻干燥后得到的标记好的肽段混合物，用100 μL流动相A(体积分数2%乙腈，体积分数98% H2O，pH10)复溶，混匀后，14 000 g离心20 min，取上清液，在Agilent 1200 HPLC上进行高pH反相色谱分离，色谱柱主要参数：Poly-SEA 5 μ 300 Å(2.0×150.0)mm，检测波长：紫外215 nm和280 nm。流速0.6 mL/min，梯度为0～30 min，由5%的乙腈增至35%；30～32 min，由35%的乙腈增至95%；32～37 min，保持95%的乙腈不变；37～39 min，乙腈由95%降至5%；39～45 min，保持5%的乙腈。色谱分离样品收集方法：0～5 min收集1管，6～44 min每4 min收集1管，45～50 min收集1管，共计12管样品溶液，然后将所有溶液彻底冷冻干燥。

1.7 液相色谱—质谱联用平台检测

用Nano-RPLC Buffer A重新溶解冻干的多肽样品。溶解后的样品以2 μL/min的流速上样到Eksigent nanoLC-UltraTM2D系统(SCIEX)的C18预柱上(100 μmol/L×3 cm，C18，3 μmol/L，150 Å)，冲洗脱盐10 min。分析柱采用C18反相色谱柱(75 μmol/L×15 cm，C18，3 μmol/L，120 Å ChromXP Eksigent)，梯度为70 min内流动相B由5%升高至35%。质谱分析采用TripleTOF5600系统结合纳升喷雾III离子源，具体参数：扫描模式为信息依赖型、母离子扫描范围为400～1 250 m/z、一级质谱分辨率≥30 000、质谱信号积累时间为250 ms、每个母离子最多触发20个二级碎片离子扫描、二级碎片的前体离子积累时间≥100 ms、二级碎片离子分辨率≥15 000、动态排除时间为20 s。

1.8 数据库检索及蛋白鉴定

采用Protein Pilot Software v.5.0软件分析试验数据，数据库来源于公共的Uniprot数据库。在错误发现率(RFD)<1%的标准下共鉴定到2 961个蛋白。差异蛋白鉴定标准：未达标准值(Unused)<1.3、肽段数(95%)≥1且差异倍数>1.3。

1.9 生物信息学

在得到差异蛋白之后，进一步做了生物信息学分析，主要包括：GO功能分类和富集分析、KEGG途经注释和富集分析、蛋白互作网络分析，用于挖掘差异蛋白的生物学功能。

2 结果与分析

2.1 铵态氮胁迫处理下差异蛋白的鉴定

基于质谱鉴定一共获得2 961个蛋白，按照差异倍数>1.30或者<0.77且P<0.05进行筛选，共得到266个差异蛋白(图1)。对获得的差异蛋白进行聚类分析，发现低质量浓度铵态氮胁迫处理和对照相比有98个差异蛋白，包括62个上调和36个下调表达的蛋白；高质量浓度铵态氮胁迫处理和对照相比有219个差异蛋白，包括139个上调和80个下调表达的蛋白(图1)。此外，有51个蛋白在低质量浓度和高质量浓度铵态氮胁迫处理的条件下都差异表达(表1)，而47个和168个蛋白只在低质量浓度或高质量浓度铵态氮胁迫处理中差异表达。以上结果说明在铵态氮胁迫下，杨树会诱导一些响应蛋白表达量的上升或下降。

图1 铵态氮胁迫下差异蛋白的分布

续(表1)

2.2 差异蛋白的GO富集分析

为了进一步研究杨树应答铵态氮胁迫的机制，通过GO注释和GO功能富集分析来解析差异蛋白的生物学功能。上述266个差异蛋白中有127个蛋白含有GO注释信息，并依据GO功能分成以下3类：细胞组分、分子功能和生物过程(表2)。在细胞组分方面，差异蛋白主要富集在细胞、胞内部分、细胞器、细胞膜等成分；在分子功能方面，主要有催化活性、水解酶活性、转移酶活性、结合等成分发生了显著变化；生物过程方面发生显著变化的成分为代谢过程、细胞过程、胁迫反应、定位和生物过程调节(表2)。

2.3 差异蛋白的KEGG富集分析

通过KEGG途经注释和显著性富集分析能够确定差异蛋白参与的生化代谢途径和信号转导途径。本研究对不同质量浓度铵态氮胁迫条件下鉴定到的差异蛋白进行了KEGG途经注释，上述266个差异蛋白中的176个有KEGG注释信息。进一步进行了KEGG富集分析，利用超几何检验方法p<0.05计算显著性，发现富集主要与能量和碳水化合物相关，包括磷酸戊糖途径、糖酵解、碳代谢、光合生物中的碳固定和氨基酸合成，另外还有一些和次生代谢相关，如苯丙素生物合成(图2)。上述结果说明能量代谢、氨基酸代谢和次生代谢物质合成等代谢途径在杨树响应铵态氮胁迫的过程中发挥了重要的生物学功能。

2.4 细胞壁完整性的维持

作为应对外界环境胁迫的第一道屏障，植物的细胞壁会快速响应，调节自身的组成和结构，从而应对外界胁迫，因此植物细胞壁的完整性在应对逆境胁迫的过程中扮演了重要的角色[20]。在本研究中，一共鉴定到11个细胞壁相关的蛋白在铵态氮胁迫下发生了显著的差异表达(表3)。在低质量浓度铵态氮胁迫下，有5个差异蛋白参与了细胞壁的调节，其中2个果胶酶上调表达。在高质量浓度铵态氮胁迫下，有8个细胞壁相关的蛋白发生了差异表达，其中大部分是上调表达，包括果胶酶、木质素过氧化物酶和角质酶。此外，也有纤维素和半纤维素酶在低质量浓度或高质量浓度铵态氮胁迫条件下发生了下调表达。上述结果表明，杨树会通过细胞壁相关蛋白的上调或下调表达来进行细胞壁完整性的维持和调节，从而应对外界的铵态氮胁迫。

表2 差异蛋白GO富集结果

图2 差异蛋白KEGG富集结果

表3 差异蛋白主要参与的功能分类

2.5 碳和能量代谢的调节

在铵态氮胁迫下，植物体内包括糖酵解、蔗糖代谢等在内的多种碳和能量相关代谢会相应地进行调节，从而有利于植物的持续生长。本研究中鉴定到杨树的8个差异蛋白参与了糖酵解代谢，其中7个蛋白在铵态氮胁迫下是上调表达，而且在高质量浓度铵态氮胁迫下上调表达的蛋白数量显著多于低质量浓度铵态氮胁迫下的蛋白(表3)，说明杨树通过调节糖酵解代谢的活性来适应铵态氮胁迫。此外，有12个差异蛋白参与了碳水化合物的代谢(表3)，其中只有2个蛋白在低质量浓度铵态氮胁迫下上调表达；而这12个蛋白在高质量浓度铵态氮胁迫下均发生了变化，且大多数都是上调表达，主要参与了蔗糖代谢、核苷酸糖代谢、淀粉代谢和氧化磷酸戊糖代谢，说明充足的能量是植物适应铵态氮胁迫的条件之一。

2.6 抗氧化系统的激活

铵态氮胁迫通常会刺激植物体内的活性氧(ROS)的产生，从而影响植物的生长和生理过程，而植物为了适应胁迫环境，减少活性氧对其的损伤，会启动相应的抗氧化系统来进行抵御[21]。本研究鉴定到17个差异蛋白参与了活性氧的解毒系统，包括11个抗坏血酸过氧化物酶(APX)、3个谷胱甘肽转移酶(GST)、2个坏血酸还原酶(MDHAR)和1个超氧化物歧化酶(SOD)(表3)。在低质量浓度铵态氮胁迫下，只有2个过氧物酶差异表达；但在高质量浓度铵态氮胁迫下，有11个过氧物酶差异表达，且其中9个都是上调表达。此外，3个谷胱甘肽S转移酶和1个超氧化物歧化酶在低质量浓度和高质量浓度铵态氮胁迫条件下均上调表达。上述结果说明在铵态氮胁迫条件下，杨树会大量诱导抗氧化系统中相关酶类蛋白的上调表达，从而抵御活性氧的负面作用。

2.7 热激蛋白的响应

在逆境条件下，植物会通过热激蛋白来减少胁迫对自身造成的伤害[22]。本研究分析发现，杨树有5个热激蛋白在铵态氮胁迫下发生了差异表达，包括2个HSP60蛋白、2个HSP70蛋白和1个HSP100蛋白(表3)。其中只有1个HSP70蛋白在低质量浓度铵态氮胁迫时上调表达，而另外4个热激蛋白在低质量浓度或高质量浓度铵态氮处理时下调表达。此外，低质量浓度或高质量浓度铵态氮胁迫下各有3个热激蛋白差异表达，表明杨树的热激蛋白在铵态氮胁迫下能快速响应，从而协助抵御铵态氮胁迫的副作用。

2.8 差异蛋白互作调控网络

为了了解差异蛋白的互作关系，将本研究鉴定到的266个差异蛋白通过String在线软件(http://string-db.org)构建蛋白质互作的调控网络，设置为高置性度(>0.9)，且隐藏没有互作的蛋白，据此得到56个差异蛋白间存在互作关系(图3)。进一步分析发现，与POPTR_0002s10420.1(葡萄糖-6-磷酸异构酶)互作的差异蛋白数量最多，有15个。此外，有16个蛋白与至少5个其它蛋白互作，有31个蛋白与至少2个其它蛋白互作，说明杨树通过调控复杂的互作网络来应对铵态氮胁迫。

图3 差异蛋白的互作网络图

3 结论与论讨

氨氮加富是导致水体富营养化的主要因素之一，而且还存在逐年加重的趋势，是目前水污染防治的关键控制因子。能否有效地控制氨氮污染，已成为遏制水污染形势加剧的关键所在。通过研究杨树对铵态氮的去除效果，探索能否利用种植杨树提升水体中铵态氮污染物的削弱效果，具有重要的应用价值。因此，监测杨树响应铵态氮胁迫的动态变化、研究杨树对铵态氮的耐受机理显得尤为重要。本研究利用iTRAQ标记定量蛋白质组学技术，分析了南林3412杨的根系蛋白质在低质量浓度和高质量浓度铵态氮胁迫下的表达变化，一共鉴定出266个差异蛋白，而且高质量浓度铵态氮胁迫下的差异蛋白数量显著多于低质量浓度铵态氮胁迫下的差异蛋白数量，表明杨树根系的差异蛋白数量与铵态氮胁迫的质量浓度成正相关，高质量浓度的铵态氮胁迫可能对杨树根系整体蛋白质的影响更大，且杨树也会通过调节更多蛋白质的表达变化来应对铵态氮胁迫。在这些差异蛋白中，有51个蛋白在低质量浓度和高质量浓度铵态氮胁迫下共同差异表达，而另外的47个和168个蛋白只在低质量浓度或高质量浓度铵态氮胁迫处理中差异表达，表明在铵态氮胁迫下，杨树根系有一些蛋白是受影响的核心途径蛋白，但杨树也会根据外界铵态氮胁迫的程度调节其他相关的蛋白来维持自身的正常生长。

在铵态氮胁迫逆境的条件下，植物会造成体内代谢失衡，导致生成过多的活性氧，而过量的活性氧会导致植物的氧化损伤，进而影响植物的信号转导、能量传递等一系列重要的生命过程[23]。为了对抗过量的活性氧，植物进化出一套相应的抗氧化系统，包括一系列的解毒活性氧的抗氧化酶[24]。本研究中鉴定到17个杨树根系的抗氧化酶在低质量浓度和高质量浓度铵态氮胁迫下发生了显著的差异表达，而且绝大多数蛋白是在铵态氮胁迫处理后上调表达，说明杨树会诱导包括抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽转移酶(GST)、坏血酸还原酶(MDHAR)和超氧化物歧化酶(SOD)在内的一系列抗氧化酶的上调表达，进而用于清除过量的活性氧。此外，本研究发现在高质量浓度铵态氮胁迫下上调表达的抗氧化酶数量要显著多于低质量浓度铵态氮胁迫下的蛋白数量，推测有可能是高质量浓度铵态氮胁迫产生更多的活性氧，导致杨树需要诱导更多的抗氧化酶来应对。

热激蛋白是一类参与非生物胁迫下受损蛋白转运和降解的分子伴侣蛋白，已有多个植物的热激蛋白报道参与了植物应对胁迫环境的过程。Chen et al.[25]发现在外界胁迫条件下，水稻线粒体HSP70上调表达，它可能是细胞程序性死亡的调节蛋白。此外，葡萄树和荞麦HSP70和HSP90的转录水平在逆境胁迫下显著差异表达，可能参与调控不同的信号转导途径[26]。在本研究中，一共鉴定到5个热激蛋白在低质量浓度或高质量浓度铵态氮胁迫下差异表达，它们包括HSP60、HSP70和HSP100，结合已有的研究报道，推测这些热激蛋白也参与了杨树应对铵态氮胁迫的信号转导途径。

本研究基于iTRAQ蛋白组学技术，分析了不同质量浓度的铵态氮胁迫条件下杨树根系的蛋白表达变化，发现高质量浓度铵态氮胁迫下的差异蛋白数量显著多于低质量浓度铵态氮胁迫下的差异蛋白数量。这些差异蛋白主要富集在能量代谢、氨基酸代谢和次生代谢物质合成等代谢途径。此外，差异蛋白参与了细胞壁完整性的维持、碳和能量代谢的调节、抗氧化系统的激活和热激蛋白的响应等重要生命过程。上述这些结果为深入揭示杨树根系响应铵态氮胁迫的调节机理奠定了基础。