不同硒源对泌乳牛瘤胃发酵及瘤胃微生物区系的影响

付 瑶，孔凡林，齐志国，王 俊，Elnazeir Mohammed Dawelbait，郭江鹏，蒋林树

（1.北京市畜牧总站，北京 100107；2.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081；3.北京农学院动物科技学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206）

微量元素硒的卓越抗氧化特性使得富硒畜禽产品的开发成为当前研究的热点之一。硒是富硒乳开发的核心成分，它不仅对奶牛的免疫功能等有积极作用，而且对维持瘤胃内环境稳定同样重要。饲料中常采用无机硒和有机硒2 种方式进行补硒。因无机硒存在潜在毒性且生物利用率低，实际生产中更倾向于使用有机硒。酵母硒为常见的有机硒源，其活性成分主要为蛋氨酸硒，但酵母硒的生物利用效率不高。高羊毛氨酸硒（Selenohomolanthionine，SeHLan）是一种新型的有机硒来源，于2007 年在添加了硒酸盐的日本辣萝卜提取物中被发现，随后，在硒化酵母提取物中鉴定出其衍生物，被学者认为是硒的一种潜在补充来源。与传统的硒代蛋氨酸（SeMet）型酵母硒相比，SeHLan 组成更稳定，且从代谢途径上来看，它只作为硒源被机体识别，生物利用效率更高。

瘤胃是反刍动物独特的消化器官，瘤胃内丰富的微生物通过代谢富硒饲粮中的硒影响其生物利用率，同时影响着瘤胃内环境。相反，硒也会影响某些瘤胃微生物的生长繁殖。科学、合理使用硒并发挥其对反刍动物瘤胃的作用意义重大。本试验旨在研究SeHLan 和亚硒酸钠（Sodium Selenite，SS）对泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃发酵及瘤胃微生物区系的影响，为更好地评估2 种硒源对奶牛的影响提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验设计及饲粮 试验采用完全随机设计。选用健康的泌乳日龄（181±18）d、日产奶（33.88±3.44）kg/d、（3.25±1.27）胎的荷斯坦泌乳奶牛32 头，分为2 组，分别饲喂添加SS、SeHLan 的2 种全混合日粮（TMR），每组16 头。基础饲粮根据奶牛体重和营养需要，参照《奶牛饲养标准》（NY/T 34-2004）配制，预混料无外源硒，基础饲粮组成及营养成分见表1。SS 为分析纯化学试剂，SeHLan 由联英管理（上海）有限公司提供，硒的添加量为15 mg/（d·头）。SS 组、SeHLan 组饲粮中硒含量实测值（干物质基础）分别为0.47 mg/kg 和0.46 mg/kg。预试期2 周，正试期9 周。奶牛每天饲喂2 次（07:00和19:00），自由采食、饮水，每天早中晚挤奶3 次。

表1 基础饲粮组成及营养成分（干物质基础）

1.2 样品采集 试验结束前的最后一天，每组选取6 头体况良好且健康的奶牛，在晨饲后4 h 通过口腔真空抽取瘤胃液，弃去开始的部分，避免口腔唾液的影响。测定瘤胃液pH 后，经4 层纱布过滤，一部分分装在50 mL离心管中，于-20℃冰箱保存用以测定氨态氮和挥发性脂肪酸（VFA），一部分分装在2 mL 冻存管中，于液氮中保存用以测定瘤胃微生物区系情况。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 瘤胃发酵指标 采用UB-7 pH 计（美国丹佛仪器公司生产）测定瘤胃液pH。采用Broderick 等文献中的靛酚蓝-分光光度法，使用UV-1601 型紫外可见分光光度计测定瘤胃液氨态氮浓度。采用Erwin 等文献中的气相色谱分析法，使用TP-2060 型气相色谱仪测定瘤胃液VFA 浓度。

1.3.2 瘤胃微生物多样性

1.3.2.1 DNA 提取和检测 按照天根生化科技（北京）有限公司的DNA 提取试剂盒说明书提取基因组DNA，使用NanoDrop2000（Thermo Scientific，MA，USA）对DNA 的浓度和纯度进行检测。

1.3.2.3 扩增及测序 用带有barcode 的特异引物扩增16S rDNA 的V3-V4 可变区。引物序列：338F（5'-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3'）。然后将PCR 扩增产物切胶回收，用QuantiFluor-ST 蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量。将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建Miseq 测序文库。由上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina 公司的Miseq PE300 平台进行测序。

1.4 统计分析 使用FLASH 软件对reads 进行拼接，通过Uparse 软件将相似性≥97%的序列聚类到同一OTU（Operational Taxonomic Unit，操作单元）并进行注释，使用QIME 软件计算微生物群落多样性，使用R 软件（vision 3.2.2）计算样品间UniFrac 距离，分析微生物群落多样性。

其他试验数据用Excel 进行初步整理，采用SAS 9.2统计软件进行单因素方差分析，处理之间差异显著性通过检验进行比较，计算标准误（SEM）和值。以＜0.05 表示差异显著，＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 SS、SeHLan 对奶牛瘤胃发酵参数的影响 由表2可知，瘤胃液pH、氨态氮浓度、各酸的比例、乙酸/丙酸、总挥发性脂肪酸（TVFA）均不受硒源的影响（＞0.05），且2 组奶牛瘤胃发酵参数均在正常范围内。

表2 SS、SeHLan 对奶牛瘤胃发酵的影响

2.2 SS、SeHLan 对奶牛瘤胃微生物群落的影响

2.2.1 SS、SeHLan 对奶牛瘤胃微生物多样性的影响利用QIME 软件对微生物OTUs 进行多样性分析，包括Sobs 指数、PD whole tree 指数、Pielou 指数、Chao1 指数、Shannon 指数。由表3 可知，各组文库覆盖率均在99%以上，说明每个样品测序量合理，可以很好地反映瘤胃微生物群落种类和结构多样性。Sobs 指数、Chao1 指数、PD whole tree 指数、Pielou 指数及Shannon 指数在两组间均无显著差异，说明采食SS 和SeHLan 饲粮的奶牛瘤胃微生物存在相似的丰富度、均匀度及多样性。

表3 SS 和SeHLan 对奶牛瘤胃微生物多样性指数的影响

2.2.2 瘤胃中细菌群落相似性 由PLS-DA 分析表明（图2），其第一主成分和第二主成分的贡献率分别为13.40% 和14.05%，采食SS 和SeHLan 组饲粮奶牛的瘤胃液样本可以明显区分并聚成2 个类群，说明瘤胃液样品中细菌群落结构差异明显。

图2 SS 和SeHLan 饲粮对应的瘤胃液中细菌群落主成分分析

2.2.3 瘤胃中细菌群落结构在门和属水平上的变化 在2 组奶牛的瘤胃微生物中鉴定出了18 个门，其中13 个门为全部样本所共有，分别为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、糖化菌门（Saccharibacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、SR1_ 棘手萤菌门（SR1_Absconditabacteria）、螺旋菌门（Spirochaetae）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、纤维杆菌门（Fibrobacteres）、互养菌门（Synergistetes）以及一种未知菌门。在这些门中，丰度占比大于1%的为Firmicutes、Bacteroidetes、Saccharibacteria、Actino bacteria、Proteobacteria 和Tenericutes，平均丰度分别为59.0%、34.6%、1.63%、1.16%、1.03% 和1.01%。由表4 可知，各组优势菌群间无显著差异。

表4 SS 和SeHLan 对奶牛瘤胃门水平微生物的影响 %

通过属水平微生物组成分析，在属水平上鉴定出227 个细菌群落，并且在所有样品中存在100 个属，这些属水平细菌属于核心微生物组。高丰度群有普雷沃氏菌属_1（）（17.49%）、解琥珀酸菌属（）（10.93%）、瘤胃球菌科 NK4A214群（）（6.41%）、瘤胃球菌属_2（）（3.44%）、毛螺菌科NK3A20 群（）（3.33%）、克里斯滕森菌科R-7 群（）（3.05%）、瘤胃球菌科_UCG-014 属（）（2.92%）、瘤胃球菌属_1（）（2.27%）、普雷沃氏菌属_7（）（2.15%）、丁酸弧菌属_2（）（2.04%）、反刍真杆菌群（[]_）（1.66%）、糖化假丝酵母菌属（）（1.63%）、普雷沃氏菌科_UCG-001 属（）（1.54%）、理研菌科_RC9 群（）（1.52%）、瘤胃球菌科_UCG-005 属（）（1.40%）、产乙酸糖发酵菌属（）（1.18%）、产粪甾醇真细菌群（[]_）（1.03%）、毛螺菌科_AC2044 群（）（1.01%）。2 组的优势菌属均为和，但其含量两组间差异不显著。

如表5 所示，2 组的显著差异性细菌有2 种。SeHLan组中高于SS 组（＜0.05），SeHLan组中低于SS组（＜0.05）。

表5 SS 和SeHLan 对奶牛瘤胃属水平微生物的影响 %

3 讨 论

3.1 SS、SeHLan 对奶牛瘤胃发酵参数的影响 瘤胃健康和牛体内环境的稳定对奶牛的生长发育具有重要意义。瘤胃液pH、氨态氮浓度及VFA 含量可以反映瘤胃发酵情况。奶牛瘤胃液pH 的正常范围为5.5～7.5，当pH 小于6.2 时，将会抑制纤维分解菌的活动。本研究中，SS 组和SeHLan 组瘤胃液pH 分别为6.38 和6.39，适宜瘤胃微生物的活动。VFA 来自于饲粮中碳水化合物的发酵，是碳水化合物分解的终物质，也是反刍动物维持和生产的主要养分和能量来源，可为反刍动物供给总能量的70%～80%。研究表明，饲粮中添加酵母硒或纳米硒可显著增加瘤胃丙酸含量，且显著降低乙酸/丙酸。但也有研究并未发现酵母硒对丙酸含量或乙酸/丙酸有显著影响。本研究结果也表明，与添加SS相比，SeHLan 对VFA 含量及乙酸/丙酸无显著影响，说明不同硒源并未对瘤胃发酵模式产生显著影响。试验结果的不同可能与硒的添加量、动物品种等不同有关。氨态氮是瘤胃微生物蛋白质合成的主要氮源，微生物对饲粮蛋白质的利用率随微生物活性的增加而增加。本试验中，SS 组和SeHLan 组氨态氮的浓度没有显著差异，且在正常值范围内（2.50～11.74 mg/dL），说明添加2种硒源未对瘤胃微生物菌群活跃度产生负面影响。

3.2 SS、SeHLan 对奶牛瘤胃微生物群落的影响 本研究中，Chao1 指数（反映微生物群落的相对丰度）、Sobs 指数（为观测的OTU 数目）及PD whole tree 指数（反映谱系多样性）变化趋势相近，未见显著差异，说明饲喂2 种硒源的奶牛瘤胃微生物具有相似的物种丰富度。本试验未观察到2 组Pielou 指数（反映群落均匀度）显著差异。Shannon 指数综合考虑了群落的丰富度和均匀度，Shannon 指数越大，代表样本均一性越好。本试验该指数在两组间无显著差异，说明两组间存在相似的均一性。

Firmicutes 和Bacteroidetes 是2 种硒源条件下奶牛的主要细菌菌门，Firmicutes 可以降解纤维和纤维素，Bacteroidetes 有助于消化碳水化合物并发酵有机物质。本研究中两者占比超过92%，与前人研究结果一致。在属水平上，占比最高，其次是，两者占比超过30%，与前人研究结果一致。本试验中，2 种硒源对Firmicutes 和Bacteroidetes、和的丰度均无显著影响。SS、SeHLan 进入瘤胃后的代谢途径不尽相同。其中，SS 一部分用于瘤胃菌体蛋白的合成，一部分被还原为不溶的硒及硒化物，一部分以亚硒酸盐的形式离开瘤胃；而SeHLan 一部分用于瘤胃菌体蛋白的合成，一部分以硒半胱氨酸的形式离开瘤胃。同时，学者发现来自变形菌门和厚壁菌门的至少15 个属的微生物（如荚膜红细菌、荧光假单胞菌等）具有将硒降解为难吸收物质的作用。在本研究中并未发现2 种硒源对硒还原和含硒蛋白合成的微生物具有显著影响，这可能是由于本研究中饲喂2 种硒源未对瘤胃发酵产生显著影响，同时与在瘤胃内发酵依靠特定种类微生物的饲粮营养成分组成相似有关。

为潜在有益菌，与纤维降解密切相关，在瘤胃内可产生纤维酶降解纤维二糖等纤维类物质，是一类典型的纤维降解菌，其含量的增加可以提高纤维消化率，与饲粮中性洗涤纤维的消化率显著相关。SeHLan 可以提高中性洗涤纤维的表观消化率。同时，研究也证实具有免疫调节的作用。本试验中，SeHLan 组含量显著高于SS组，推测SeHLan 组具有更好的提高奶牛免疫力的作用。在临床上作为免疫、结肠炎鉴定的标志微生物，其丰度越高表示免疫力或抗病性越低。本试验中SeHLan 组显著低于SS 组，因而推测SeHLan 对提高奶牛免疫力或抗病性的作用更好。

4 结 论

本试验结果表明，与添加SS 相比，饲粮中添加SeHLan 未对泌乳中期荷斯坦奶牛瘤胃发酵类型产生显著影响；二者对瘤胃微生物丰富度以及主要优势菌门和优势菌属无显著影响，但在属水平上检测到2 种具有显著差异的功能性细菌和。