普通培养法联合革兰染色Nugent评分在BV相关GV鉴别诊断中的临床应用

陆庭嫣，曹轶越，刘安庆，沈 俐，肖 晔，方晓霞，杨海鸥

上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院检验科/上海市胚胎源性疾病重点实验室，上海 200030

阴道加德纳菌(GV)是女性细菌性阴道病(BV)的主要病原菌之一。妊娠期女性GV感染可引起输卵管妊娠、胎膜早破、绒毛膜羊膜炎、新生儿早产、新生儿败血症、产后败血症和脓毒血症等不良妊娠结局[1-3]；非妊娠期感染可引起输卵管炎、盆腔炎、间质性膀胱炎等妇科疾病[4-5]。BV相关GV感染是阴道微生态菌群紊乱的表现，在阴道菌群平衡被打破的状态下容易合并多种病原菌感染[6-8]。因此，本研究对本院2018年BV相关GV检出率、临床分布及与其他病原菌合并感染等情况进行了统计分析，旨在探索一种能正确识别BV相关GV感染的方法，并结合与其他病原菌混合感染情况，为BV感染患者针对性、综合性治疗提供一定的科学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2018年所有检测女性阴道拭子或宫颈拭子普通病原菌培养项目的门诊及住院患者。

1.2仪器与试剂 基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS，布鲁克)、哥伦比亚血琼脂培养基(科马嘉)、革兰染色试剂(珠海贝索)。

1.3方法

1.3.1标本采集 用无菌棉拭子于阴道深部或阴道后穹窿、宫颈口等处取材，采集完成后将棉拭子放入标本保存管内，立即送检。

1.3.2普通培养法 取出标本保存管内棉拭子，在哥伦比亚血琼脂平板上均匀涂抹一区，用接种环分区划线接种。将接种好标本的哥伦比亚血琼脂平板置于37 ℃、5%～10%CO2的CO2培养箱中孵育于24、48 h后观察。GV在哥伦比亚羊血琼脂中不溶血，菌落特征为细小灰白色，染色性为革兰阴性小杆菌或阴阳性不定小杆菌[9]。

1.3.3质谱鉴定 由于GV菌落较为细小，所以用竹牙签尽可能多地挑取上述可疑菌落均匀涂抹在MALDI靶板的标本孔位中，同时添加1 μL标准品溶液至1个标本孔位中，在自然晾干后的标准品和标本上加1 μL70%甲酸，晾干后再加1 μL基质溶液。自然晾干后将靶板放入靶板舱，进行样品测定。

1.3.4质谱鉴定 质控菌株为GV标准菌株ATCC14018。参照IVD MALDI Biotyper2.3用户手册，将临床标本GV鉴定分值≥2.000的结果确认为种的水平，鉴定分值在1.700～1.999的结果确认为属的水平。

1.3.5革兰染色 在对培养平板上有可疑GV菌落质谱鉴定的同时也将其拭子标本进行涂片革兰染色。涂片干燥后经火焰固定，加结晶紫染10 s，清水冲去染液；加碘液染10 s，水洗；加95%乙醇脱色液，不时摇动5～10 s，至无紫色脱落为止，水洗；加沙黄复染10 s，水洗。干燥后置于显微镜10×100油镜下观察阴道菌群进行Nugent评分。

1.3.6Nugent评分[10]Nugent评分是国际通用的较准确诊断BV的实验室方法。显微镜10×100油镜区分以下形态的细菌：革兰阳性大杆菌(乳酸杆菌)、革兰染色阴阳性不定小杆菌(GV)、革兰阴性小杆菌(拟杆菌)、革兰染色阴阳性不定的弯曲杆菌(动弯杆菌)等。根据每个油镜视野细菌数量，换算成积分，再按公式(总积分=乳酸杆菌+GV和拟杆菌+动弯杆菌)计算总积分。Nugent评分0～3分为正常；>3～<7分为中间型；≥7分为BV。

1.3.7病例查询 通过患者门诊号或住院号查询BV相关GV患者需氧菌、真菌、支原体培养及其他检测信息，统计BV相关GV患者合并混合感染种类和感染率。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据处理及统计分析。计数资料采用频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1普通培养法联合革兰染色Nugent评分的GV检出情况分析 2018年共有8 653份做病原菌培养检测的女性阴道拭子或宫颈拭子标本。当普通培养法发现哥伦比亚血琼脂平板有GV特征性菌落生长时，挑取可疑菌落用MALDI-TOF MS仪进行鉴定，最终检出GV 881份，检出率10.18%。GV鉴定阳性且Nugent≥7分的有691份(78.43%)，为BV相关GV组；GV鉴定阳性但Nugent<7分的有190份(21.57%)，为GV定植菌组；GV鉴定失败但Nugent≥7分的有123份。在Nugent评分≥7分的标本里有75.92%可见典型线索细胞。

2.2BV相关GV组患者临床分布 691例BV相关GV组患者门诊分布以妇科门诊最多(48.48%，335/691)，其次为宫颈门诊(12.74%，88/691)。病区分布以肿瘤病区最多(8.97%，62/691)、其次为妇科内窥镜病区(6.51%，45/691)，产科病区最少(3.33%，23/691)。见表1。

表1 BV相关GV组患者临床分布

2.3BV相关GV组患者混合感染类型分布 691例BV相关GV组患者中，混合感染632例，混合感染率91.45%。混合感染病原菌主要包括需氧菌(AV)、阴道假丝酵母菌(VVC)、解脲支原体(UU)、人型支原体(MH)、衣原体(CT)、滴虫(TV)、淋球菌(GC)、疱疹病毒2型(HSV-2)、人乳头状瘤病毒(HPV)等。不同混合感染例数与感染率见表2。

表2 BV相关GV组患者混合感染类型分布(n=691)

3 讨 论

BV是以阴道正常优势乳酸杆菌比例下降或缺失，相关微生物过度增殖而引起的无阴道黏膜炎症表现的临床综合征。与BV相关的微生物主要有GV、拟杆菌、动弯杆菌、普雷沃菌属、UU、MH等[11]。虽然有研究显示GV是BV相关致病菌中最主要的病原菌[12-13]，但有关标准与指南并不推荐以单纯分离培养GV作为诊断BV的方法[14]。因为GV可以存在于超过50%的健康女性阴道微生物菌群中，只有高浓度GV才常与BV发生有关[11]，所以并不能以单纯培养结果作为独立的BV诊断标准。因此，2015年美国指南建议，使用革兰染色Nugent 评分(首选)或Amsel标准作为诊断BV的“金标准”[14]。

笔者在日常工作中发现，本院的女性阴道拭子或宫颈拭子在进行病原菌培养检测过程中，常常被发现在哥伦比亚血琼脂平板上有生长比较良好单一的细小灰白GV特征菌落，也有与其他需氧菌混合生长的GV菌群。虽然有研究者认为，GV生长营养要求苛刻，需要配置专用培养基才能良好生长[15]，但本实验室在实际培养观察中发现，GV在哥伦比亚血琼脂平板上亦可生长良好且比较容易区分辨认。为了能正确区分BV相关GV及避免因菌群混杂导致GV鉴定失败而造成BV漏检，笔者在对培养平板上有可疑GV菌落质谱鉴定的同时也将其拭子标本进行革兰染色Nugent评分，从而确认了691例(78.43%)GV与BV相关患者，另外也补充了GV鉴定失败但革兰Nugent评分判定为BV阳性的123例，所以该方法可以作为BV诊断的一种补充检测手段，在指导临床针对性治疗BV相关GV、避免药物滥用等方面可发挥重要作用。

本研究结果显示，BV相关GV患者以妇科门诊(48.48%，335/691)和宫颈门诊(12.74%，88/691)最多。这可能是因为妇科门诊和宫颈门诊就诊患者多为有临床症状的阴道病感染高危人群。在GILLET等[16]的一篇Meta分析中也提到，BV与宫颈HPV感染呈显著相关。而体检门诊人群以健康者为主，相对应的BV相关GV检出率也较低(2.53%，12/475)，符合人群分布特点。妇科相关病区(肿瘤病区、内窥镜、妇科病区)BV相关GV检出率(7.55%，151/2 000)明显高于产科病区(2.72%，23/845)，提示BV感染可能与妇科生殖道各类疾病密切相关[17-18]，同时应重视BV患者经阴式妇科手术及宫腔镜术前的针对性治疗，进而降低术后发生感染的风险。在计划生育科，人工流产造成的子宫内膜损伤导致阴道正常防御机制的破坏，更容易造成子宫内膜慢性炎症，因而在计划生育术前对确诊的BV进行针对性治疗也非常重要。

BV相关GV混合感染类型以合并支原体、VVC、HPV感染最为常见。在合并支原体感染中，合并UU占36.10%，同时合并MH占30.74%，合并MH仅占8.39%。虽然合并UU比例最高，但未分型UU在健康人群中的携带率高达10%～30%，其临床意义还需结合临床表现综合评判[19-20]。合并MH占比虽低，但有研究表明，MH感染可致产后发热，与子宫内膜炎及盆腔炎具有相关性[21-22]，因此，应对合并MH感染患者应及时进行针对性干预治疗。GV产生唾液酸酶是生物膜形成中的重要步骤，而生物膜的形成可能是HPV感染持续存在的风险因素[23-24]。以GV、拟杆菌、动弯杆菌、普雷沃菌属等厌氧菌过度增殖而乳酸杆菌缺失造成的阴道微生物菌群的紊乱也增加了性传播疾病易感风险。因此，区分BV相关GV患者，并明确是否有MH、VVC、HPV及性传播疾病等合并感染，在预防与针对性治疗妇科相关感染性疾病中存在一定的指导意义。

综上所述，GV是BV相关致病菌中最主要的病原菌，阴道拭子普通培养法联合革兰染色Nugent评分不但可以区分出与BV相关GV及GV定植菌，而且还能作为GV鉴定失败但以Nugent评分确认BV阳性的补充手段。BV合并VVC、支原体、HPV感染及STD感染在临床较为常见，因此，在进行生殖道疾病临床诊治时明确病原菌，区分是单纯感染还是混合感染，将有助于临床制订针对性的综合治疗方案，合理选择与使用抗菌药物，进而避免因抗菌药物滥用而产生的耐药问题，也在一定程度上降低了患者的经济负担。