没食子酸对高脂血症小鼠的保护作用

郗艳丽 ， 赵峻秀 ， 陈 响 ， 谭振宇 ， 冯小雨 ， 马洪波 , 赵洺琦

(吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林 132103)

高脂血症又称脂代谢紊乱，可导致脂肪肝、心血管疾病、冠心病、胰腺炎及动脉粥样硬化等疾病[1-3]，对患者生命健康产生威胁，临床中较为重视高脂血症及其引起的并发症[4]，也广泛开展了相关研究。目前市场上常用的他汀等降脂药物，多为西药，且有些药物具有肝损害等不良反应[5]。开发天然低毒的降脂药物，能给高脂血症患者带来福音。高脂血症的发病机制与氧化应激损伤有关。没食子酸(Gallic acid，GA)是我国传统中药五倍子、普洱、石榴、掌叶大黄、灵芝等中草药植物的主要成分之一，是化学结构简单且毒性小的天然多酚类化合物[6-7]，其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗菌等多种生物活性，具备发展为新的降血脂药物的潜力[8-9]。张旭等研究发现，没食子酸对谷氨酸钠诱导的肥胖小鼠有显著的降脂作用，其能有效改善血清及肝脏中的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平[10]。目前关于没食子酸降脂作用机制的研究较少，其药效和作用机制有待进一步研究。没食子酸的毒性较低，生物安全性高[11]，是传统中药材中的常见成分，若能深入研究没食子酸的降脂作用机制，可拓展没食子酸的应用领域，提高传统中药材的利用价值和经济价值。因此，本试验以高脂血症为研究对象，重点探讨没食子酸对脂肪乳诱导高脂血症小鼠的保护作用，明确没食子酸对高脂血症小鼠的治疗作用及其可能的作用机制，为临床治疗提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 没食子酸(Gallic acid,Sigma公司)；胆固醇和脱氧胆酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；吐温80和1,2-丙二醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)；猪油(自制)；护肝片(黑龙江葵花药业股份有限公司)；丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、总胆固醇(Total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和总蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程公司)；血糖试纸(三诺生物传感股份有限公司)。

1.2 主要仪器 SynergyH1M酶标仪(美国BioTek)；BS224S-CW电子分析天平(德国赛多利斯科技仪器)，NIU普通光学显微镜(日本尼康)，EG1150生物组织包埋机(德国Leica)，RM2245病理切片机(德国Leica)，T10组织分散机(德国IKA)；血糖仪(三诺)。

1.3 实验动物 ICR小鼠，清洁级，体重18～22 g，购自长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(吉) 20180007。饲料，购自长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(吉)201901092。试验前小鼠适应性饲养5 d。饲养条件：温度18～22 ℃，湿度45%～65%，12 h明暗交替，自由饮水摄食。

1.4 试验方法

1.4.1 脂肪乳的制备 30%猪油、10%胆固醇、10%吐温80、20%1,2-丙二醇、3%脱氧胆酸钠以及27%的水。制成高脂乳剂于4 ℃储存，使用前37 ℃水浴加热融化。

1.4.2 试验分组与给药 60只ICR小鼠，雌雄各半，按体重随机区组[12]分为对照组、脂肪乳组、护肝片组、62.5 mg/(kg·bw)、125 mg/(kg·bw)和250 mg/(kg·bw)没食子酸组。除对照组外，其余各组小鼠以20 mL/(kg·bw)脂肪乳剂连续灌胃8周。试验第4周，除对照组和脂肪乳组外，护肝片组给予30 mg/(kg·bw)护肝片溶液灌胃，没食子酸组分别给予62.5、125 mg/(kg·bw)和250 mg/(kg·bw)没食子酸溶液灌胃，连续4周。末次给药后，禁食不禁水24 h，眼球取血处死小鼠。取全血，置于4 ℃离心机中，3 000 r/min离心10 min，分离上清，置于-20 ℃冰箱保存。切取相同部位的肝脏组织固定于4%多聚甲醛溶液中，剩余组织冻存于液氮中，用于后续检测。

1.4.3 血清中指标测定 取血清，按照试剂盒说明书步骤测定血清中ALT、AST、SOD、NOS、TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量。取全血，血糖试纸测定小鼠血糖值。

1.4.4 肝组织中SOD、MDA、NO和NOS含量的测定 将肝小叶按1∶9(m/v)加入预冷的生理盐水(pH 7.4)中，用眼科剪剪碎组织，置于组织破碎仪中匀浆，4 ℃ 4 000 r/min离心10 min，取上清液制成组织匀浆。按试剂盒说明书步骤测定肝组织匀浆中SOD、MDA、NO和NOS含量。

1.4.5 苏木精-伊红(H.E.)染色 将固定好的肝组织常规石蜡包埋，切片备用，H.E.染色后光学显微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 情况观察 各组小鼠的生长发育、活动均正常，未发现中毒死亡。

2.2 没食子酸对各组小鼠血生化指标的影响 由表1可知，与对照组比较，脂肪乳组小鼠血清中ALT、AST、LDL-C、TC、TG和血糖水平显著升高(P<0.05)。与脂肪乳组比较，护肝片组、没食子酸各剂量组小鼠血清中ALT和TG含量显著降低(P<0.05)；250 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠血清中AST、LDL-C、TC含量显著降低(P<0.05)；护肝片组、125 mg/(kg·bw)和250 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠血清中血糖水平显著降低(P<0.05)。与护肝片组比较，没食子酸各剂量组小鼠血清中ALT含量显著降低(P<0.05)；250 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠血清中AST和LDL-C水平显著降低(P<0.05)。与62.5 mg/(kg·bw)没食子酸组比较，125 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠血清中TG水平显著降低(P<0.05)；250 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠血清中AST、LDL-C和TG水平显著降低(P<0.05)。与125 mg/(kg·bw)没食子酸组比较，250 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠血清中AST含量显著降低(P<0.05)。

表1 没食子酸对各组小鼠血生化指标的影响

2.3 没食子酸对各组小鼠血清和肝脏中氧化应激标志物的影响 由表2可知，与对照组比较，脂肪乳组小鼠血清中SOD含量显著降低、NOS含量显著升高，肝组织中MDA和NO含量显著升高、SOD含量显著降低(P<0.05)。与脂肪乳组比较，护肝片组小鼠肝组织中SOD含量显著升高，NOS含量显著降低(P<0.05)；125 mg/(kg·bw)和250 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠血清中NOS含量显著降低，肝脏中NO含量显著降低(P<0.05)；没食子酸各剂量组小鼠肝组织中MDA和NO含量显著降低(P<0.05)；250 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠肝组织中NOS含量显著降低(P<0.05)。与护肝片组比较，没食子酸各剂量组小鼠肝组织中MDA和SOD含量显著降低，62.5 mg/(kg·bw)和125 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠肝组织中NOS含量显著升高(P<0.05)。与62.5 mg/(kg·bw)和125 mg/(kg·bw)没食子酸组比较，250 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠肝组织中NOS含量显著降低(P<0.05)。62.5、125 mg/(kg·bw)和250 mg/(kg·bw)没食子酸组小鼠血清中SOD和NOS之间比较，无显著差异(P>0.05)，肝组织中MDA、SOD和NO含量之间比较，也无显著差异(P>0.05)。

表2 没食子酸对各组小鼠血清和肝脏中氧化应激标志物的影响

2.4 病理组织学观察 由图1可知，各组肝组织经过H.E.染色后，对照组小鼠可见正常肝细胞结构，细胞核清晰可见，肝细胞围绕中央静脉呈放射状整齐排列，形成细胞索，无显著边界分隔。脂肪乳组小鼠肝组织细胞边界不清楚，细胞质可见空泡，部分细胞可见脂肪变性肿大，细胞核清晰可见，但分布偏离。可见大量炎性细胞浸润。没食子酸处理后，肝脏脂肪变性明显减少，细胞肿胀程度减轻，细胞核位置处于正常状态。

图1 没食子酸对小鼠肝组织的影响(H.E.染色，100×)

3 讨论

高脂血症是以TC、TG、LDL-C升高，HDL-C降低为主要临床特征的一类疾病[13]，随着人们生活水平的不断提高，高脂血症发病率逐年增高。目前，我国成年人中，血脂异常患病率可达40.40%[14]，高脂饮食是导致高脂血症患病率不断升高的重要因素[15]。本试验发现，没食子酸能显著降低脂肪乳剂引起的血脂升高，能显著降低TC、TG和LDL-C水平，改善HDL-C水平，对高脂血症小鼠的血脂异常有一定的治疗作用。相较于没食子酸低、中剂量组，没食子酸高剂量组对血脂的降低效果最显著。

SOD是细胞内负责清除超氧阴离子自由基的重要抗氧化酶，是反映机体抗氧化能力的敏感指标[16]。MDA是多不饱和脂肪酸脂质过氧化作用的产物，是反应机体内脂质过氧化的重要指标之一[17]。NO是一种新型的自由基，在体内具有广泛的生物活性[18]。NOS广泛存在于人和哺乳动物的组织中，能催化底物L-精氨酸生成NO[19]。近年来研究发现，NO和NOS的升高与高脂血症所致组织器官损伤密切相关[20]。国内外研究显示，没食子酸具有较好的抗氧化和清除自由基的作用。本试验结果显示，脂肪乳组血清中SOD水平显著低于对照组，而没食子酸高剂量组血清SOD水平显著高于脂肪乳组，血清NOS水平显著低于脂肪乳组。此时，血脂水平也恢复到接近正常水平。这些结果进一步证实了高脂血症的发生与氧化应激有关，而没食子酸对高脂血症的治疗作用与抗氧化酶活性增加以及自由基清除有关。

国内外有关学者的研究结果还发现，高脂血症会导致肝组织病变并伴随糖代谢紊乱，原因是高脂血症患者氧化应激和脂质过氧化反应增强，多余脂肪沉积在肝组织，引起肝细胞变性或坏死，加重肝细胞脂质代谢紊乱。肝组织作为糖合成与分解的重要器官，当肝组织出现损害以及脂代谢紊乱时，会导致糖代谢也出现紊乱[21-22]。血清中的ALT和AST水平与肝细胞损害程度呈正相关，是反映肝细胞发生损害的敏感标志物[23]。本试验中发现，脂肪乳组小鼠血清中的ALT和AST水平显著升高，这表明小鼠给予高脂饮食后，肝组织因脂肪堆积而发生了损伤。而没食子酸能显著降低血清中ALT和AST水平，能显著减轻脂肪乳剂导致的肝脏组织损伤。在没食子酸高剂量组中，小鼠肝组织SOD水平显著升高，MDA水平显著降低，NO和NOS水平显著降低。这提示，没食子酸能通过调节氧化酶活性并降低脂质过氧化损伤作用，进而维持氧化和抗氧化之间的平衡，改善小鼠肝组织的氧化损伤程度。小鼠肝组织病理学检测结果进一步证实了没食子酸对脂肪乳剂引起的肝组织炎性反应和脂肪变性有改善作用。此外，给予没食子酸后，血清中的血糖水平也明显下降，这提示没食子酸对糖脂代谢紊乱都有改善作用。这些结果表明没食子酸能通过调节肝组织功能，降低血脂和血糖水平，改善糖脂代谢紊乱。

综上所述，没食子酸增强了小鼠的抗氧化活性，在降低血脂水平的同时能改善脂肪乳剂引起的肝组织病理改变和肝功能损伤。没食子酸可以作为治疗和预防糖脂代谢紊乱、心脑血管疾病、动脉粥样硬化的理想候选药物。