黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌纤维化的影响

张亚平，赵世明，任可可，吴聪聪，史卓暄，刘 玲

心肌纤维化是在高血压、心肌梗死及瓣膜性心脏病中发生的一种病理学改变，其特征是间质性成纤维细胞增殖和过度生成及心肌细胞外基质(ECM)的沉积，包括胶原蛋白和纤连蛋白，被认为是确定心脏病临床结局的重要危险因素[1-3]。黄芩苷是黄芩干燥根中的主要成分，是一种天然多酚，黄芩苷具有多种生物学活性，包括抗炎、抗氧化、抗血栓形成、抗增殖和凋亡调控[4]。研究表明，黄芩苷对四氯化碳诱导的肝纤维化具有保护作用[5]，并且可以抑制肾脏纤维化[6]。研究报道，黄芩苷对心血管疾病具有一定的保护作用，例如对动脉粥样硬化的抑制作用、对抗心肌缺血再灌注损伤并抑制内皮功能障碍[7-9]。但黄芩苷对心脏纤维化的作用研究较少。本研究通过结扎左冠状动脉前降支，建立心肌梗死后心肌纤维化大鼠模型，探究黄芩苷对心肌纤维化大鼠的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级健康SD雄性大鼠 40 只，6～8周龄，体质量(220±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。将动物圈养在温度可控的房间里，光照时间为12 h，温度为22～24 ℃，湿度为50%～60%，给予标准的实验室食物和任意的自来水，实验前适应性饲养1周。

1.2 药物、试剂和仪器 黄芩苷(纯度>99%)购自上海阿拉丁公司；ECL发光液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒、RIPA裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂购自上海碧云天公司；苏木精-伊红(HE)染色液购自北京索莱宝公司；Masson染色液购自北京雷根生物公司；兔抗大鼠胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ)单抗(ab260043，Abcam)，胶原蛋白Ⅲ(Collagen Ⅲ)单抗(ab7778，Abcam)，兔抗大鼠纤连蛋白(fibronectin，FN)单抗(ab268020，Abcam)，兔抗大鼠p38单抗(ab170099，Abcam)，兔抗大鼠p-p38单抗(ab4822，Abcam)，兔抗大鼠Smad2单抗(#5339，CST)，兔抗大鼠p-Smad2单抗(#18338，CST)，小鼠抗大鼠转化生长因子(TGF)-β1(sc-65378，santa cruz)，兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单抗(ab181602，Abcam)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫吸附球蛋白G(IgG)抗体(ab6728)，兔抗小鼠IgG H&L(HRP)(ab6728，Abcam)，白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、IL-10及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒均购自武汉博士德公司。ALC-V8S 型小动物呼吸机购自上海阿尔科特生物公司，彩色多普勒超声心动图仪购自美国ACUSON公司(Sepuoia512)，台式高速低温离心机购自美国Beckman Coulter公司，凝胶电泳仪购自美国 Bio-rad 公司，荧光显微镜购自日本OLYMPUS公司，酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3 动物模型的建立和给药

1.3.1 模型建立 将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、黄芩苷12.5 mg/kg组、黄芩苷25 mg/kg组和黄芩苷50 mg/kg组，每组8只[10]。模型组、黄芩苷12.5 mg/kg组、黄芩苷25 mg/kg组和黄芩苷50 mg/kg组大鼠处理如下[11]：用戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，后背位固定，经口气管插管连接小动物呼吸机辅助呼吸，于左胸第3肋与第4肋间打开胸腔，暴露心脏。确定左冠状动脉前降支位置(肺动脉圆锥与左心耳交界处)，用5/0手术线进行结扎，心室前壁变苍白，室壁运动明显减弱。用棉球吸除胸腔内液体，挤出胸腔内气体，逐层缝合，观察有自主呼吸后拔除插管。假手术组只穿线不结扎。术后24 h将心电图没有 ST 段改变的造模大鼠剔除，最终每组选取6只。

1.3.2 给药方法 黄芩苷各组大鼠按照相应剂量分别给予黄芩苷12.5 mg/kg、25 mg/kg和50 mg/kg灌胃，每天1次，连续灌胃4周。假手术组和模型组灌胃等体积生理盐水。

1.4 心功能指标检测 超声心动图检测大鼠心脏变化。异氟烷吸入麻醉大鼠，心前区脱毛后取仰卧位，经胸行超声检查，探头频率为 2～4 MHz，测量左室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)。左室收缩功能通过左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)进行评估。完成检测后腹主动脉采血，离心后取上清于-20 ℃保存，颈椎脱臼处死大鼠，解剖取出心脏组织，每组各取3只大鼠的心脏组织于-80 ℃保存，另外3只大鼠的心脏组织保存于4%多聚甲醛溶液中。

1.5 心肌酶学检测 取出于-20 ℃保存的大鼠血清，用自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量。

1.6 HE染色检测心肌组织病理学变化 各组大鼠心肌组织在4%多聚甲醛溶液中浸泡24 h后，经梯度乙醇脱水，石蜡包埋后切片，厚度为4 μm。脱蜡，行HE染色，脱水透明封片，镜下观察心肌组织病理学变化(×400)。

1.7 Masson染色检测心肌纤维化 心肌组织切片按Masson染色试剂盒步骤操作，使用Image-ProPlus软件镜下观察拍照，并计算胶原容积分数(CVF)。显微镜下心肌组织为红色，胶原纤维为蓝色。CVF(%)=胶原纤维染色面积/切片总面积×100%。

1.8 蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测蛋白表达 用RIPA 裂解液提取大鼠心肌组织蛋白，采用 BCA 法测定各组蛋白浓度。蛋白样品上样量为35 μg，经SDS-PAGE在电泳缓冲液中电泳分离，将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗3次，每次10 min；加入稀释的一抗(GAPDH 1∶1 500、Collagen Ⅰ 1∶1 000、Collagen Ⅲ 1∶1 000、FN 1∶1 000、t-p38 1∶1 000、p-p38 1∶1 000、Smad2 1∶1 000、p-Smad2 1∶1 000和TGF-β11∶1 000)4 ℃静置过夜。TBST 洗膜3次，每次10 min，用HRP标记的山羊抗兔和兔抗小鼠二抗(1∶4 000)37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL显色，用Image J图像分析软件进行灰度值分析。

1.9 ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的水平 按照ELISA 试剂盒说明书采用酶标仪检测各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10水平。

2 结 果

2.1 心脏功能指标比较 与假手术组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD明显升高，LVFS、LVEF明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，黄芩苷25 mg/kg组和黄芩苷50 mg/kg组LVEDD、LVESD明显降低，LVFS、LVEF明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心脏功能指标比较(±s)

2.2 心肌酶水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，黄芩苷25 mg/kg组和黄芩苷50 mg/kg组大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心肌酶水平比较(±s) 单位：U/L

2.3 心肌组织病理形态和纤维化比较 HE染色：假手术组肌束紧密有序，形态规则，胞核完整；模型组心肌组织被破坏，心肌细胞破碎，细胞核固缩变形，失去原有的结构；黄芩苷25 mg/kg组和黄芩苷50 mg/kg组心肌组织形态较模型组规则，细胞膜完整见(见图1A)。Masson染色：模型组大鼠心肌组织有大量蓝色胶原纤维沉积，纤维化程度严重，CVF较假手术组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；黄芩苷25 mg/kg组和黄芩苷50 mg/kg组纤维化程度明显减轻，CVF较模型组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05，见图1B)。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05。图1 各组大鼠心肌组织病理形态和纤维化情况[A为HE染色和Masson染色(×400)；B为各组CVF比较，n=3]

2.4 纤维化相关蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和纤连蛋白表达水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，黄芩苷25 mg/kg组和黄芩苷50 mg/kg组大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和纤连蛋白表达水平均明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图2。

与假手术组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。图2 各组大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和纤连蛋白表达情况[A为Western Blot检测Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和纤连蛋白表达情况；B为各组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和纤连蛋白相对表达量比较(n=3)]

2.5 炎性因子水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，黄芩苷25 mg/kg组和黄芩苷50 mg/kg组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显降低，IL-10水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血清炎性因子水平比较(±s)单位：ng/L

2.6 p38/TGF-β1/ Smad2通路指标比较 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中p38、Smad2磷酸化水平及TGF-β1蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，黄芩苷25 mg/kg和黄芩苷50 mg/kg组大鼠p38、Smad2磷酸化水平及TGF-β1蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图3。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05图3 各组大鼠心肌组织中p38、Smad2磷酸化水平及TGF-β1蛋白的表达比较[A为Western Blot检测蛋白表达；B为蛋白相对表达量比较(n=3)]

3 讨 论

心肌梗死后，由于心肌细胞外基质沉积和降解失衡，胶原纤维替代了坏死的心肌组织，进而导致瘢痕组织积聚，心肌病理重塑和心脏功能下降[12]，主要病理特征为心室增大和LVEF降低，且随着时间的推移不断恶化，LVEF降低是心力衰竭的主要临床表现[13]。本研究显示，心肌梗死模型大鼠心室增厚，LVEF和LVFS明显下降，出现心脏收缩和舒张障碍，黄芩苷可改善心肌梗死过程中心室收缩和舒张功能，减少包括CK、CK-MB和LDH在内的心肌酶释放。因此，黄芩苷能够改善心肌梗死大鼠的心脏功能。

研究表明，黄芩苷通过抑制心肌胶原蛋白的体积分数和其他相关纤维化标志物发挥改善自发性高血压大鼠心脏纤维化的作用[14-15]。黄芩苷可以改善各种器官内的纤维化效应，例如肺纤维化[16]和肾纤维化[6]。本研究HE 染色和 Masson染色结果显示，模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，形态不规则，细胞间隙能够看到大量胶原纤维增生。经黄芩苷处理后心肌组织的病变程度降低，胶原蛋白容积分数减少，并逆转模型组大鼠Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤连蛋白的表达上调，表明黄芩苷可减轻心肌梗死造成的心肌纤维化及心肌功能损伤。

心肌梗死后第1个小时，心肌中就发现了炎性细胞的浸润[17]。炎症通过刺激胶原蛋白沉积以补偿在心脏修复过程中心肌细胞的丢失，因此，长期、不充分的抑制炎症可能会导致胶原蛋白在心脏中过度沉积，使心脏壁变硬，从而损害心脏功能[18]。黄芩苷通过抑制IL-6和IL-23来减轻二氧化硅诱导的肺部炎症和肺纤维化[19]。Zhao等[4]研究表明，黄芩苷可以明显减轻博来霉素引起的大鼠肺纤维化和炎症反应。本研究结果显示，黄芩苷处理可明显抑制心肌梗死引起的IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的释放，促进抗炎因子IL-10的分泌。因此，黄芩苷能明显减轻心肌梗死大鼠的心肌炎症。

越来越多的证据表明，TGF-β/Smad信号通路对于纤维化的发生至关重要，并且广泛认可Smads在TGF-β诱导的细胞外基质(ECM)成分过度积累中的重要作用[20]。研究表明，黄芩苷通过上调腺苷A2a受体、下调TGF-β1和磷酸化p-ERK1/2表达来抑制博来霉素诱导的肺纤维化[21]。本研究表明，黄芩苷通过下调心肌梗死模型大鼠中TGF-β1和p-Smad2的表达，抑制TGF-β/ Smad信号通路活化，从而减轻心肌梗死后纤维化。除了TGF-β/Smads途径，TGF-β还参与几种丝裂原活化蛋白激酶的非经典信号传导通路，包括ERK1/2和p38 MAPK[22]。p-ERK1/2和 p38 MAPK通路的抑制可有效抑制心肌梗死大鼠心肌纤维化[23]。本研究表明，黄芩苷可明显降低p38的磷酸化水平，从而抑制心肌细胞外基质的沉积和心肌纤维化发展。

综上所述，本研究表明，黄芩苷可以减轻心肌梗死大鼠的心功能障碍，通过减少胶原沉积和促炎因子分泌抑制了心肌纤维化的发展。黄芩苷抗纤维化的作用可能与抑制p38的磷酸化及TGF-β1/Smad2通路相关。本研究为黄芩苷的临床应用提供了依据，但黄芩苷抗纤维化的具体机制仍需进一步探讨。