纳米抗体特性及其在农产品真菌毒素检测中的应用

蔡冲，闫洪林，唐晓倩，张奇,2,3,4,5，张文,2,3,4,5*，李培武,2,3,4,5*

（1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北 武汉， 430062；2.农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，湖北 武汉， 430062；3.农业农村部生物毒素检测重点实验室，湖北 武汉， 430062；4.农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室（武汉），湖北 武汉， 430062；5.国家农业检测基准实验室（生物毒素），湖北 武汉， 430062）

抗体（antibody）作为免疫系统的核心材料一直备受关注，传统的单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）、多克隆抗体（polyclonal antibody，pAb），以及近年来兴起的基因工程抗体在农业和生命科学等领域占据举足轻重的位置。纳米抗体（variable domain of heavy chain of the heavy chain antibody,VHH）作为基因工程抗体的一种，由于具有特异性强、稳定性高、产量高、耐受有机溶剂等优点得到突飞猛进的发展[1，2]。骆驼科动物（单峰骆驼、双峰骆驼、羊驼等）体内既存在传统的单克隆抗体，又含有一种结构和功能都比较特殊的重链抗体（heavy chain antibodies, HCAbs）。HCAb 由抗原结合结构域和恒定结构域组成。而驼源纳米抗体就是由骆驼科动物血清中提取的HCAb，其中的抗原结构域，不含有轻链和第一常数结构域（the first constant domain,CH1），仅含有重链可变区的自然结构域的一种工程抗体[3～5]。

本文总结了纳米抗体国内外研究进展，旨在介绍其结构、生化特性以及其在农产品真菌毒素检测中的应用，以期为纳米抗体的充分开发和利用，特别是为其在农产品真菌毒素检测方面的应用提供科学依据。

1 纳米抗体的结构

纳米抗体为目前发现的尺寸最小的天然抗原结合片段，分子量仅为15 kDa，是传统单克隆抗体分子量（150 kDa）的十分之一，小于同为基因工程抗体的单链抗体（single-chain fragment variable, scFv,分子量为27 kDa）和抗原结合片段（fragment antigen binding, Fab, 分子量约为57 kDa），其结构如图1 所示。纳米抗体直径为2.5 nm，高度为4 nm。折叠的VHH 由9 条β 链组成，这些β 链组成一个四链β 折叠和五链β 折叠，由互补决定区（complementary determining region, CDR）和骨架区（fragment region,FR）内存在的二硫键连接[6]。VHH 结构呈现紧凑的扁长型，类似于橄榄球，形成一个凸状互补表位，VHH 具有强大的抗原结合能力，可以轻松地接触到蛋白表面的空洞或裂隙[7,8]，而这些空洞或者裂隙是传统单克隆抗体无法接触到的。

大体上VHH 的结构与抗体重链可变区（variable region of heavy chain, VH）相似，但也存在些许差异：

（1）VH 上FR2 区的高度保守的疏水氨基酸（Val37，Gly44，Leu45和Trp47）分别被亲水和（或）更小的氨基酸取代，一般为Phe37、Glu44、Arg45 和Gly47，分别对应于图1 纳米抗体结构FR2 区域红色标注的四个特征氨基酸。这些疏水氨基酸通常参与传统抗体轻链和重链的组装过程中，因此重塑此段结构可以提高纳米抗体的溶解度并减少聚集[6,9,10]。

图1 单克隆抗体、单链抗体、抗原结合片段、重链抗体和纳米抗体结构示意图Fig.1 Schematic diagram of the structure of monoclonal antibody,scFv,Fab,heavy chain antibody and nanobody

（2）纳米抗体CDR 区较长，特别是CDR3 区，在骆驼科动物中平均长度为16 个氨基酸，而人和鼠VH 的CDR3 区分别为14 和12 个氨基酸，这通常被认为是弥补缺少的轻链部分，以提供足够大的区域结合抗原[11]。对VHH 和抗原结合物进行X 衍射分析，结果表明CDR3 区为抗原抗体结合的主要贡献部分[12]，并且CDR3 区有助于纳米抗体和抗原形成稳定的络合物，类似于常规抗体与抗原的结合。而且纳米抗体更易于识别抗原某些隐蔽表位，例如酶的活性位点，较长的CDR3 区可以形成一个突出的环状结构，从而使纳米抗体可以结合特殊的构象表位[8,13,14]。例如，有人认为这些突出的环可能对靶向活性位点裂隙和隐秘的病毒表位具有特殊识别效果[15]。

（3）在许多的驼源纳米抗体中，往往在CDR1 区和CDR3 区之间有二硫键的存在，有少数情况也位于CDR3 区和FR2 区之间[16]。此二硫键可能会限制CDR 区的柔韧性，可以实现更强的相互作用；也有报道称，此二硫键可以使纳米抗体识别更多的表位[10]。

2 纳米抗体的生化特性

2.1 高亲和力

VHH 与scFv有所区别，scFv是通过PCR技术扩增在B细胞中成熟的重链可变区和轻链可变区的外显子随机组装而成，而VHH 则是通过存在于外周B淋巴细胞的外显子直接通过PCR 技术扩增即可获得一个紧密的、较高亲和力的抗体。VHH 获得的动力学kon和koff速率常数范围分别为105～106M-1·s-1和10-2～10-4s-1，因此纳米抗体可以在纳摩尔甚至是皮摩尔范围内表现出亲和力表位，这意味着纳米抗体较传统抗体或者其它基因工程抗体有相当或更高的亲和力[12,17,18]；另一种解释方法为，纳米抗体结构中的CDR1 区和CDR3 区相连接的二硫键会明显降低结合物的熵值，从而使得纳米抗体具有较高亲和力[8]。

2.2 高稳定性

VHH 与多克隆抗体相比，各个生产批次之间相对稳定，没有较大的波动。另外，一般情况下VHH具有较高的稳定性，在4℃可以保存几个月，在-20℃的温度下可以保存更长的时间，与抗原的结合能力不受影响[9]。Zhang[19]等将纳米抗体与单克隆抗体进行热稳定性的比较，研究结果表明，纳米抗体在80℃加热60 min 后仍保留有30%的活性，而单克隆抗体在80℃加热10 min 后与抗原的结合能力全部丧失。并且有研究表明，纳米抗体较单克隆抗体和单链抗体的优势在于当温度下降时，纳米抗体可以恢复天然构象，而其它抗体构象改变是不可逆的[1,20]。同时，He等[21]探究在不同有机溶剂处理下纳米抗体和单克隆抗体的活性变化，结果表明纳米抗体对甲醇、丙酮、乙腈和二甲基亚砜的耐受性强于单克隆抗体。

2.3 易表达

单克隆抗体是大型多聚体蛋白质，需要进行翻译后修饰。因此，单克隆抗体生产需要在动物体内完成，通常需要大量的哺乳动物以及繁琐的纯化步骤，从而导致昂贵的生产成本并限制其发展。相反，纳米抗体可以在微生物系统（如大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母）、哺乳动物细胞体系或植物中高水平表达[22]。例如大肠杆菌表达系统，细菌每20 min 可复制一次，一般的培养时间为15 h，每升的培养基中可以获得几毫克的产量[23]，He 等[21]使用E.coliTOP 10F′表达系统纯化后的纳米抗体产量为4.2 mg/L；在酵母表达系统中可以获得更高的产量，Chen 等[24]使用P. pastoris表达系统纯化后的纳米体产量为51.71 mg/L。

2.4 其它性质

纳米抗体具有简单的基因序列，适宜于改造与修饰，从而实现某些特定的需求。由于纳米抗体的FR2 区域被四个亲水氨基酸所取代，因此纳米抗体具有高亲水性，较VL 更易形成双价或多价的偶联形式[25]。例如，Fan[26]等将纳米抗体以24聚体的方式在磷酸铁蛋白上展示，形成一个新型的平台，并命名为fenobody。透射电镜分析结果显示，纳米抗体以6×4 束的排列方式围绕在铁蛋白的表面，此种结合方式较常规的纳米抗体不仅在空间结构上更加灵活，而且有更高的亲和力，且亲和力提高约180倍。

根据晶体学研究表明，抗原的结合表面是平坦或者凹入的，纳米抗体的表面有一个凸起的抗原结合位点，使得它们能够结合凹入的或者以其它方式结合受到严重阻碍的抗原的表面，这种能力使得纳米抗体可以充当酶抑制剂，可以识别更加隐蔽的表位，这是其它种类抗体所达不到的[8]。

骆驼科VHH 与人VH 具有高度的同源性，驼源纳米抗体在动物实验和临床试验中均未引起动物或者人类的免疫反应，这意味着纳米抗体较单克隆抗体更加适合作为治疗药物[5]。另外，纳米抗体表现出更强的药物代谢能力、更好的透过血脑屏障的能力，再次验证了纳米抗体的巨大潜力[11,27]。

3 纳米抗体在农产品检测中的应用

3.1 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）是指以酶作为标记物，利用抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。根据抗原和抗体性质的不同，常见的ELISA方法包括直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争抑制法等。ELISA 是一种操作方便，可以用于大规模筛选、省时省力的研究方法，根据纳米抗体的体积小特性，对其进行加工修饰，可以建立方便、快捷且高灵敏的ELISA检测技术。Houwelingen[28]等通过使用赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）完全抗原（OTABSA）免疫羊驼，筛选到与OTA特异性相结合的纳米抗体，通过建立竞争ELISA测定其灵敏度（half-maximum inhibition concentration, IC50）为12 ng/mL。除了传统形式上的ELISA 检测方法外，目前有许多学者聚焦在纳米抗体的修饰上，通过将纳米抗体与其它信号标签融合实现高灵敏的ELISA 检测（表1）。Sun[29]等描述了纳米抗体与AviTag 标签融合并使用生物素-链霉亲和素扩增（biotin-streptavidin-amplified, BA）ELISA 法，高灵敏、高精准地检测谷物中OTA。此方法较基于纳米抗体ELISA 方法的灵敏度提高了4 倍，与液相色谱质谱法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS）相比显示出良好的一致性，可以应用于实际样品的检测。Sun[30]等将抗OTA 特异性纳米抗体与碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）融合表达，融合蛋白既保留了纳米抗体与抗原之间特异性结合能力又具有酶促活力。为监测水稻中的OTA 含量，建立一步竞争ELISA 法检测，所建立方法的IC50为0.57 ng/mL，检出限（limit of detection,LOD）为0.059 ng/mL，分别较基于纳米抗体ELISA 分别提高了1.1 和2.7倍。

抗体表面主要有三种决定簇：同种型决定簇（isotypic determinant）、同种异型决定簇（allotypic determinant）和独特型决定簇（idiotypic determinant）。根据丹麦科学家Jerne提出的免疫网络学说，抗体的独特型决定簇可以诱导机体产生抗独特型抗体，此抗体和靶分析物竞争一抗的相同结合区域，这样的抗体称之为抗独特型抗体[31]。通过文库筛选到的抗独特型纳米抗体可以用于替代高毒抗原以及标准品的使用，减少对操作人员的危害同时也避免了对环境造成的二次污染，便于建立安全、无毒的实验环境，具有广阔的应用前景。Wang[23]等使用黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）单克隆抗体免疫羊驼，建立免疫噬菌体展示文库，通过生物淘选策略从文库中筛选到可以与AFB1单克隆抗体特异性结合的纳米抗体。使用筛选到的纳米抗体作为包被抗原，建立农产品中AFB1的竞争ELISA 检测方法，所建立方法对AFB1的IC50为0.16 ng/mL，对黄曲霉毒素B2（aflatoxin B2,AFB2）、黄曲霉毒素G1（aflatoxin G1,AFG1）和黄曲霉毒素G2（aflatoxin G2, AFG2）的交叉反应分别为90.4%、54.4%和37.7%。因此所建立的方法可以用于花生或饲料中总黄曲霉毒素进行鉴定。Zhao[32]等利用淘选出的AFB1的特异型纳米抗体（Nb28）作为“抗原”，从商品化的12肽库中筛选到与Nb28 相结合的纳米抗体作为Nb28 的模拟表位，即AFB1的抗独特型纳米抗体（命名为ME17）。利用ME17 和Nb28 开发了一种快速磁珠定向竞争ELISA（magnetic beads-based directed competitive ELISA,MB-dcELISA）。同时抗独特型纳米抗体还可以替代小分子真菌毒素标准品，Wang[33]等使用AFB1抗独特型纳米抗体（VHH 2-5）替代AFB1标准品，通过建立VHH 2-5 与AFB1之间的定量转换方程，定量测定农产品中AFB1含量。

3.2 免疫聚合酶链式反应法

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是一项利用DNA 复制原理，在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。这项技术可以不依赖大肠杆菌或者酵母菌等生物体，在短时间内实现目的基因大量扩增。免疫聚合酶链式反应（immuno-PCR,IPCR）则是将免疫学技术与PCR 技术相结合形成的一种全新的免疫检测方法，其原理与ELISA 方法相似。ELISA 方法是利用显色深浅来定量，而IPCR 技术则是利用扩增DNA 分子为分析目标物，根据扩增目的片段的量进行痕量分析，往往灵敏度更高，检测限更低[34,35]。

Ji[36]等通过从天然噬菌体展示文库中筛选到与OTA 单克隆抗体相特异性结合的纳米抗体，即OTA抗独特型纳米抗体。采用此纳米抗体噬菌体形式建立了非毒素IPCR 的定量检测方法应用于农产品中OTA 的检测。该检测方法的LOD 为4.17 pg/mL（表1）。此方法较于噬菌体ELISA 的检出限提高了9 倍。同样，Liu[37]建立OTA 的IPCR 检测方法，LOD值为3.7 pg/mL，线性范围为0.01～1000 pg/mL。此方法与常规ELISA 相比具有良好的一致性，可以实现谷物中OTA的定量检测。

表1 纳米抗体在农产品真菌毒素检测中的应用Table 1 Application of nanobodies for determination of mycotoxins in agriculture products

Lei[38]等基于AFB1抗独特型纳米抗体的M13 噬菌体及其编码DNA 设计特异性引物，建立准确定量检测农产品中AFB1的IPCR 方法，检测灵敏度比传统的噬菌体ELISA 提高了4 倍，且以玉米、大米、花生等黄曲霉毒素污染的主要农作物为检测样本，验证了该方法的有效性。为了解决农产品多种真菌毒素混合污染同步检测技术难题，Ren[39]等建立了一种抗独特型纳米抗体噬菌体展示介导IPCR方法，编码抗独特型纳米抗体的特定DNA 序列用于设计PCR 扩增引物，此方法用于同时测定谷物中总黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN），其检测结果与高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）具有较高的一致性。

3.3 免疫传感器法

近几年中，免疫传感器（immunosensor）因其小巧、方便、易于使用并且能够在现场即时检测而受到了广泛的关注与应用。免疫传感器是一种将生物信号转换为可识别信号的分析设备。免疫传感器通常由三个部分组成：嫁接到传感器表面的配体，该配体可以通过特定的相互作用识别目标；将转换器表面的生物信号转化为可识别的物理信号；放大并分析信号的检测器[40,41]。

Pan[42]等基于纳米抗体分子量较小的特点和纳米材料的电化学特性，开发了一种针对AFB1小分子直接、高灵敏检测的电化学免疫传感器。与使用单克隆抗体制备的免疫传感器相比，此免疫传感器的线性范围扩大了两个数量级，灵敏度提高了10 倍，具有可重复性和高稳定性。Liu[43]等建立一种基于纳米抗体的免疫传感器，与辣根过氧化物酶串联体修饰的杂交链反应信号放大系统相结合，实现了对AFB1的快速、超灵敏的检测。在最佳的条件下，免疫传感器的LOD 为68 fg/mL，线性范围为0.5～10 ng/mL。此传感器与其它常见的小分子真菌毒素无交叉反应，且具有良好的稳定性。生物传感器具有响应快速、高度自动化、支持现场检测等优点，因此建立与不同新材料相结合的检测手段，以期拓宽对农产品中真菌毒素超灵敏检测的研究。

3.4 侧向流免疫分析法

侧向流免疫分析（lateral flow immunoassay,LFIA）是现场检测真菌毒素的一种重要手段，与其它检测手段相比最显著的一个优点是不需要大型仪器的支撑，仅需要可携带的小型仪器或肉眼便可以实现结果的判定。侧向流免疫分析适用于现场检测、操作方便、灵敏度高、成本低、可以批量生产，因此得到了较为广泛的应用[44]。

农产品中真菌毒素多为混合污染，因此建立农产品中多种真菌毒素的同步检测技术是十分必要的。Yan[45]等建立了一种基于量子点/量子点微球（quantum dots/quantum dot microbread, QDs/QB）多重免疫层析法（multiplex immunochromatographic assay, mICA），用于对伏马毒素B1（fumonisin, FB1）、ZEN 和OTA 高灵敏度、多组分同步检测。选择QD和QB 作为荧光基因指示剂，与抗真菌毒素的单克隆抗体偶联。此外，将FB1、ZEN 和OTA 的抗独特型纳米抗体与麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein,MBP）的可溶性单价融合体作为模拟包被抗原喷涂于检测线。采用此种检测方法可以在10 min内得到结果，对于FB1、ZEN 和OTA 的视觉检测限分别为0.25 ng/mL、3.0 ng/mL 和0.5 ng/mL。经验证，此方法具有良好的准确性、可重复性和实用性，适用于现场快速检测。Tang[46]等为同时检测玉米或玉米制品中AFB1和ZEN，使用两种毒素的抗独特型纳米抗体与新型的Eu/Tb(III)纳米球相偶联，并将纳米球作为标记物。建立了时间分辨荧光免疫纸层析（time-resolved fluorescence immunochromatographic assay, TRFICA）同步检测方法，方法对于AFB1和ZEN 的IC50分别为0.46 ng/mL 和0.86 ng/mL，相比较使用两种毒素对应单克隆抗体所建立的TRFICA方法灵敏度分别提高了18.3和20.3倍。

3.5 其它方法

Tang[47]等认为纳米抗体中的色氨酸残基可以用于激发检测OTA 和赭曲霉毒素B（ochratoxin B,OTB）的受体荧光。因此，建立了一种非竞争性、均相荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）免疫分析方法，用于同时检测OTA和OTB。在最佳条件下，基于纳米抗体的FRET 方法对OTA 和OTB 的检出限分别为：0.06 ng/mL 和0.12 ng/mL。且与其类似物交叉反应率可以忽略不计，在加标回收试验中有良好的准确度。Tang[48]等研制出一种快速现场检测谷物中OTA 的免疫分析方法。此方法是将纳米抗体与碱性磷酸酶融合后固定在聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上，对OTA 进行一步定性的视觉检测，检测过程可在6 min 中内完成，并证明此方法可以用于实际样品检测。

4 结论与展望

农产品安全关系到人民生命健康以及产业高质量发展。农产品的种、收、贮、运的各个环节均容易受到真菌毒素的污染，不仅造成巨大的经济损失还容易影响人畜健康。因此，迫切需要建立快速、灵敏的检测手段以用于检测农产品真菌毒素的污染情况。免疫学检测手段的快速发展使得这种需要成为可能，抗体作为免疫学检测的核心材料更是得到了突飞猛进的发展。在分子克隆和表面展示技术快速发展的推动下，已研制出多种纳米抗体应用于农产品真菌毒素检测。本文综述了纳米抗体的特性及在农产品真菌毒素检测中的应用，具体分析了纳米抗体的结构和生化性质，比较分析了酶联免疫吸附测定法、免疫聚合酶链式反应法、免疫传感器法、侧向流免疫检测法等在农产品真菌毒素检测中的应用，以期为农产品真菌毒素检测与监测提供参考。在目前的实际工作中，纳米抗体在小分子分析方面的性能与传统抗体相当，易于适应开发快速、高灵敏性检测痕量分析物的方法。但是，由于真菌毒素均为小分子物质，从展示文库中淘选到理想的纳米抗体具有一定的难度与挑战，阻碍了纳米抗体的发展。因此，在免疫学与生物学的基础上，需要进一步探索和开发具有丰富多样性、大容量的展示文库构建手段；快速、廉价、高效的纳米抗体筛选技术；高灵敏、高特异性纳米抗体的制备技术，以适应于农产品真菌毒素检测与监测的广泛需求，并朝向自动化与智能化的方向发展。