通过表型和基因型鉴定筛选适合春油菜区的优异种质

徐亮，林建荣，杜德志

（国家油菜改良中心青海分中心/农业农村部春油菜科学观测实验站/青海省春油菜遗传改良重点实验室/青海省春油菜工程技术研究中心/青海大学农林科学院，青海 西宁， 810016）

油菜是最我国重要的油料作物，2018 年国家统计局数据表明，全国油菜种植面积达9826.5 万亩（折合655.1 万公顷），总产1328.1 万吨。每年可生产优质菜籽油约520 万吨，占国产植物油的47%；每年生产高蛋白饲用菜籽粕约800 万吨，是我国第二大饲用蛋白源[1]。

我国油菜分为春油菜和冬油菜两个生态类型。春油菜主要分布在青海、甘肃、新疆、内蒙古、西藏等省（区），总面积约66.7 万公顷，其中甘蓝型油菜面积约43 万公顷，占春油菜总面积的64.5%[2]。青海省甘蓝型春油菜资源主要从加拿大等少数春油菜国家引进，数量少、遗传基础狭窄，抗（耐）菌核病性较弱。为了拓宽甘蓝型春油菜资源的遗传基础，青海省从长江流域引进了一批半冬性甘蓝型油菜资源，研究发现，半冬性甘蓝型油菜资源与春性甘蓝型油菜的遗传差异较大，且两者间的遗传差异大于春性与春性资源间、半冬性与半冬性资源间的遗传差异，半冬性甘蓝型油菜资源的抗（耐）菌核病性显著强于春性甘蓝型油菜品种（系）[3,4]，春性品种（系）与半冬性品种（系）组配的杂交种比同种类型品种（系）间组配的杂交种具有更强的杂种优势[5]，春油菜中导入半冬性油菜遗传成分，可以增强春油菜杂种优势，提高杂交种产量和菌核病抗性[6]。

基于上述研究结果，“十二五”期间，青海省又从国内引进了一批甘蓝型油菜资源。本研究对这批资源进行了遗传多样性分析，鉴定其开花时间、茎秆强度、产量和品质等相关性状，以期为春油菜新品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

收集于“十二五”期间，来自国家油菜产业技术体系和国内科研单位。通过5 代自交纯化，淘汰农艺性状和品质性状较差、初花期与甘蓝型春油菜青油14 号差异超过10 d 的资源，获得了124 份农艺性状稳定的甘蓝型油菜。由于在青海生态环境下，长江上游区的资源普遍表现早熟，而黄淮海地区的资源普遍表现晚熟，因此这两个生态区中选的资源较少。因此本研究以这124 份资源和青海原有的20份春油菜品种（系）为材料（表1）。

表1 144份甘蓝型油菜品种（系）基本信息Table 1 Information of 144 germplasm resources in Brassica napus

续表

1.2 方法

利用50K SNP 芯片（包含42 090 个甘蓝型油菜SNP 标记，由武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发）对144份甘蓝型油菜资源进行基因型分析，以差异位点占总检测位点的比率作为两个样品间的遗传距离，差异位点越少，对应两个样品的遗传距离就越近，得到一个n×n的二维遗传距离矩阵（n指用于聚类的总样品数）。利用R语言的ape和phangorn 包的UPGMA 方法对上述的距离矩阵构建系统发育树。在https://itol.embl.de/网站进行可视化，并使用不同颜色注释样品来源信息。所有材料基因型分析试验由武汉双绿源创芯科技研究院有限公司完成。

2019 年所有材料种植于青海省农林科学院田间试验区，试验采用随机区组设计，两次重复，每小区3 行，行长2 m，行距0.3 m（小区面积1.8m2）。出苗后及时间苗除草，3～4叶期按株距0.15 m进行定苗，其它栽培措施按试验区常规管理进行。

开花期调查：调查出苗到初花的时间。

茎秆强度相关性状测定：成熟期收获子叶节以上20～40 cm 茎段6 根，挂好编号并放置阴凉潮湿处，取样当天用茎秆强度测定仪（型号YYD-1，中国浙江托普仪器有限公司生产）测量茎折断力、茎壁穿透力；用数显游标卡尺（精度0.01 mm）测量茎段近地端的直径、茎壁厚度、木质部厚度，每根茎段测量两个部。由于茎折断力与茎直径呈显著正相关，为了消除茎直径对茎折断力的影响，采用单位茎横切面积抗断力作为茎秆强度的评价指标，计算公式为：

茎秆强度=茎抗断力/πr2

（把油菜茎秆视为圆柱体，r为茎秆半径）。

产量和品质性状测定：成熟期考查小区产量，并收获6 个单株进行考种，考查角果长度、每角粒数、千粒重；用近红外光谱仪（BRUKER MATRIX-1）检测种子的芥酸含量、硫甙含量和含油量。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

利用50K SNP 芯片的基因型数据计算144 份甘蓝型油菜资源两两之间的遗传距离，最大遗传距离为0.7561，最小遗传距离为0.0049，平均遗传距离为0.4683，遗传距离大于等于0.5 的资源对数占总对数的36.45%，表明这批资源的遗传多样性丰富。按照资源两两之间的遗传距离构建系统发育树，结果见图1。从图1可以看出，除了来自西北春油菜区的资源外，同一来源的资源没有明显地聚在一起，表明地理距离与遗传距离没有明显的相关性，不再适合作杂交种双亲遗传距离选择的依据。

图1 144份甘蓝型油菜资源系统发育树Fig.1 UPGMA tree of 144 germplasm resources in Brassica napus

以同一来源的资源作为一个类群，分析同一类群内和不同类群之间的平均遗传距离，结果见表2。类群内平均遗传距离普遍小于不同类群之间的平均遗传距离，但黄淮海区的资源群内平均遗传距离反而大于其与其它类群间的遗传距离，表明黄淮海区的资源存在丰富的遗传变异。长江上游区、长江中游区和长江下游区三个类群的资源，群内和群间的平均遗传距离都不大，表明这三个类群之间资源交流更频繁。西北春油菜类群内部平均遗传距离为0.4189，与国外资源群之间的遗传距离为0.4478，与黄淮海资源群、长江流域的三个类群之间的遗传距离均超过0.5，表明西北春油菜资源群内遗传差异相对较小，与国内四个类群间存在较大的遗传差异。

表2 甘蓝型油菜资源遗传距离Table 2 Genetic distance of germplasm resources in B.napus

进一步分析发现，在西北春油菜资源群和长江中游资源群内，部分资源之间存在明显的亲缘关系，遗传距离小于0.1 的资源各有13 对。根据这一结果推测，在西北春油菜区和长江中游区，育种家使用了更为相近的优良品种为亲本创制资源。

2.2 重要性状表型变异

144份甘蓝型油菜的13个重要性状表型变异分析结果见表3。品质性状方面，芥酸含量和硫甙含量有较大的变异系数，主要原因是这些资源含少数几个品质为双高的资源；来源于国外、西北区和黄淮区的资源平均含油量高于长江流域的资源。茎秆强度相关性状方面，来源于长江流域的资源具有较粗的茎秆，来源于国外的资源平均茎直径最小；来源于国外的资源茎壁厚度较小；长江流域和黄淮区的资源茎折断力高于西北区和国外的资源；黄淮区和下游区的资源茎秆强度值相对较大；六个类群资源在木质部厚度和茎穿透力两个性状上没有显著差异。产量性状方面，来源于长江中游区和国外资源具有较多的每角粒数；来源于长江流域的资源千粒重较大；长江下游区的资源平均小区产量最高，其次是上游区，平均小区产量最低的是黄淮区的资源；以春油菜区推广面积最大的常规品种青油14号为对照，筛选出小区产量超过青油14号的资源55 份，其中长江中游22 份，长江下游13 份，长江上游4份，黄淮区1份，西北春油菜区15份。

表3 不同来源甘蓝型油菜资源重要性状分析Table 3 Phenotypic analysis of germplasm resources in B.napus

144份资源中，茎直径超过17 mm 的资源有6份（X621、X553、X603、X573、X459、X567），木质部厚度超过1 mm 的资源8 份（X377、X567、X553、X545、X565、72Y、X393、X411），这些资源更容易获得较大的生物产量，可用于饲用油菜资源创新和新品种选育。鉴定筛选出茎折断力超过80 N 的资源12 份（X621、157Y、X565、X567、X545、X469、X641、X579、X651、X603、X591、X457），茎秆强度超过40 N/cm2的资源15 份（X473、157Y、X621、X667、X449、X581、X625、X631、X641、X469、X549、X499、X639、X503、X617），这些资源可用于抗茎倒油菜资源创新和新品种选育。在产量及其相关性状上，鉴定筛选到小区产量超过600 g 的资源5 份（X457、X399、X603、X373、X555），千粒重超过6 g 的资源9 份（X599、X515、X511、X535、X531、X399、X593、X371、X603），这些资源可用于产量性状的改良。筛选到含油量超 过48% 的 资 源9 份（X653、X555、X553、X431、X665、X635、X551、121Y、159Y），这些资源可为高含油量春油菜品种选育提供有利的基因资源。

2.3 综合性状优良资源的遗传差异分析

在144 份资源中，筛选出小区产量超过青油14号的资源，同时品质达到双低标准、含油量超过40%、每角粒数大于20粒、茎秆强度超过30 N/cm2作为综合性状优良的资源共22 份。对这些资源的遗传距离进行分析，筛选出遗传距离大于等于0.4 的资源对（表4）。大量的研究已经证明，遗传差异是杂种优势利用的基础，在一定的范围内，遗传差异与杂种优势呈正相关，表4 的资源对可为甘蓝型春油菜杂交种亲本选配提供参考，也可用于改良现有优良亲本系，进一步拓宽亲本间的遗传差异。

表4 综合性状优良资源的遗传距离矩阵（≥0.4）Table 4 Genetic distance matrix of resources with excellent comprehensive traits (≥0.4)

3 讨论

3.1 遗传多样性评价方法

遗传多样性是杂种优势利用的基础。早期主要利用地理来源和表型性状来评价种质资源的遗传差异[7～10]，但随着油菜遗传育种的发展，种质资源的跨区交流更加频繁、表型性状易受环境影响等问题，限制了这两种方法在种质资源遗传多样性评价中的应用。本文的研究结果也进一步证明，地理来源难以有效地评价种质资源的遗传差异。

蛋白质检测技术[11,12]和基于DNA 水平的分子标记技术[13～22]在油菜遗传多样性评价中得到广泛应用，但这些技术存在检测位点数少、检测效率低、检测时间长等问题。近来年，基因组测序和SNP 芯片技术已经用于油菜遗传多样性研究[23～26]，使得遗传多样性评价更准确、高效。本研究利用50K SNP 芯片进行遗传多样性分析，可以检测全基因组4.2 万个位点，数据过滤优化之后获得高质量的SNP 标记28 491 个，利用这些基因组数据进行遗传多样性分析，能更准确地反映种质资源在基因组水平的遗传差异。

3.2 杂种优势模式和亲本选育方法

杜德志等[4～6]研究表明，甘蓝型春油菜杂交种亲本组配模式中，“春性×半冬性”的亲本组配模式的杂种优势强于“春性×春性”、“半冬性×半冬性”两种模式组配的杂交种，同时在春油菜中导入半冬性油菜遗传成分，也可以增强春油菜杂种优势、提高杂交种的产量和菌核病抗性。而得出以上研究结果的重要原因是春性甘蓝型油菜与半冬性甘蓝型油菜之间具有较大的遗传差异。本文的研究也进一步证明，西北春油菜区的资源与长江流域的资源存在较大的遗传差异。

外来资源的引进，一方面可以拓宽育种资源的遗传基础，但另一方面也加大了杂交种选育过程中亲本选配的工作量和复杂性。在育种过程中，确保杂交种双亲有较大的遗传差异是很有必要的，结合本研究的结果，在春油菜杂交种选育过程中，可以构建两个杂交种亲本群，一个亲本群由国外和西北春油菜优良育种材料构成，另一个由长江流域的优良育种材料组成。在杂交种亲本选育过程中，用其中一个亲本群的资源相互杂交或回交转育的方法选育新的不育系和保持系，用另一个亲本群的资源相互杂交或回交转育的方法选育新的恢复系，采用这种方法可以确保不育系与恢复系之间有较大的遗传差异。

3.3 春油菜区资源引进与利用

通过对国内外144 份甘蓝型油菜资源的生育期、产量、品质、抗倒性和遗传差异进行分析，结果表明，来源于长江中游和长江下游的资源在春油菜区表现较好，更容易筛选出符合育种目标的品种资源。基于这一结果，在今后资源引进与利用中，可侧重引进和利用长江中游和长江下游的资源，以提高育种效率。