参麦方对心肌细胞糖脂毒性损伤的保护作用

关婉辰 戴璐彬 张栋 周凯旋 刘佳 鲍慧玮 李丽静 (长春中医药大学，吉林 长春 130117)

老年2型糖尿病(T2DM)患病率逐年增加〔1〕，因此对于糖尿病的改善和控制已势不可挡。T2DM患者常伴有血糖血脂代谢异常，导致长期高血糖和高血脂在体内堆积，产生的糖脂毒性对机体多组织器官造成损伤，其中对心肌功能的危害最大，为研究天然药物改善糖脂毒性损伤的发病机制，本文选用古典名方参麦方进行研究，参麦方中人参和麦冬可等分同用，都能益气养阴，润肺清心〔2〕，参麦方注射剂型已被临床证实能改善T2DM大鼠的心功能〔3〕，为模拟细胞在体内高糖高脂环境和出于对用药的长期性考虑，本研究选用参麦方口服剂型在体外建立H9C2细胞糖脂损伤模型，探讨参麦方对大鼠心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验细胞 H9C2大鼠心肌细胞：北京协和细胞资源中心提供。

1.2实验药物

1.2.1参麦方含药血清制备 15只雄性SD大鼠随机分为空白组、参麦方低、高剂量组，每组5只。空白组给予蒸馏水，参麦方低、高剂量组分别按照1.1 g/kg、5.4 g/kg给予自制参麦方水煎液灌胃，连续3 d，3次/d，末次给药1 h后，20%乌拉坦麻醉，腹主动脉取血，离心取上清液，灭活过滤备用。

1.2.2主要溶液制备 棕榈酸溶液：取10 ml超纯水匀速加入0.209 g棕榈酸钠，水浴加热至70℃溶解，即配制成0.075 mol/L 棕榈酸水溶液，同时在30 ml超纯水中加入6 g牛血清白蛋白(BSA)缓慢搅拌加热至完全溶解，配制 20%的BSA水溶液，将3 ml 0.075 mol/L棕榈酸水溶液缓慢滴加到20%BSA水溶液中，70℃加热搅拌，充分交联后，制成7.5 mmol/L的棕榈酸溶液，迅速使用0.22 μm滤膜过滤除菌，放于4℃冰箱保存备用。葡萄糖溶液：称取1.8 g葡萄糖，吹打溶解于超纯水中，制备成1 mol/L的葡萄糖储备液，在超净台中使用0.22 μm滤膜过滤除去细菌和杂质，分装后保存于4℃冰箱。

1.3主要材料与试剂 人参(批号：200301，北京同仁堂健康药店)、麦冬(批号：20190301，北京同仁堂健康药店)、棕榈酸(批号：SLBD2406V，Sigma公司)、葡萄糖(批号：D9434，Sigma公司)、乳酸脱氢酶试剂盒(批号：20190523，南京建成生物工程研究所)、Hoechst33258染色试剂盒(批号：1224192009-08，碧云天)。

1.4H9C2细胞糖脂毒性模型的建立 H9C2细胞接板培养后，加入不同浓度梯度的棕榈酸(0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.75、1.00 mmol/L)和葡萄糖(10、20、30、40、50 mmol/L)，并设立正常对照组，干预24 h后，每孔加入10 μl CCK8，1 h后450 nm波长下检测每孔OD值，计算细胞存活率，选取棕榈酸与葡萄糖最适杀伤浓度，建立H9C2糖脂毒性模型。同等方法加入不同浓度梯度的参麦注射液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/ml)计算细胞存活率，选取参麦注射液的最适给药剂量进行后续实验。

1.5H9C2细胞糖脂毒性损伤的检测

1.5.1参麦方含药血清对糖脂毒性损伤的H9C2细胞存活率影响 H9C2细胞以体积100 μl/孔,密度5×103个/孔，“蛇形顺序”接种在96孔板中，使用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基培养细胞，24 h后弃培养液，分组给药，细胞分为正常对照组(含10%空白大鼠的血清的DMEM高糖培养液)、糖脂模型组(10%空白大鼠血清+0.40 mmol/L棕榈酸和30 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培养液)、参麦注射液组(10%空白大鼠血清+0.40 mg/ml参麦注射液)、参麦方低剂量组(10%参麦方低剂量大鼠血清+0.40 mmol/L棕榈酸和30 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培养液)、参麦方高剂量组(10%参麦方高剂量大鼠血清+0.40 mmol/L棕榈酸和30 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培养液),给药干预后酶标仪检测细胞存活率。

1.5.2磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化(p)-蛋白激酶B(AKT)/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达检测 Western印迹检测蛋白PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR。最终以内参GAPDH的灰度值比值进行统计学分析。

1.5.3形态学观察H9C2细胞凋亡 细胞接种6孔板给药处理后，按 Hoechst 33258 试剂盒方法每孔加入150 μl 5 μg/ml染色液进行避光染色，最终使用荧光显微镜观察拍照。

1.5.4H9C2细胞的凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活性半胱天冬酶(Cleaved-Caspase)3表达检测 同1.5.2方法检测凋亡蛋白Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1H9C2细胞糖脂毒性模型的建立

2.1.1H9C2细胞脂毒性浓度筛选 与正常对照组相比，棕榈酸组存活率呈剂量依赖性下降，其中0.40 mmol/L棕榈酸组存活率达69.4%，损伤程度可缓，实验重复性稳定，因此选用0.40 mmol/L棕榈酸来建立脂毒性损伤模型。见表1。

表1 棕榈酸最适浓度筛选

2.1.2H9C2细胞糖毒性浓度筛选 与正常对照组比较，葡萄糖组存活率呈剂量依赖性下降，30 mmol/L条件下葡萄糖损伤可缓，因此选用30 mmol/L葡萄糖来建立糖毒性损伤模型。见表2。

表2 不同高糖浓度下损伤H9C2心肌细胞存活率的影响

2.1.3参麦注射液给药浓度筛选 与正常对照组相比，参麦注射液组在0.4 mg/ml条件下，H9C2细胞存活率最高(P<0.01)。见表3。因此选用0.4 mg/ml浓度进行后续实验。

表3 参麦注射液对H9C2心肌细胞存活率的影响

2.2参麦方含药血清对H9C2细胞糖脂毒性模型存活率的影响 与正常对照组比较，糖脂模型组存活率降低具有统计学意义(P<0.01)；与糖脂模型组比，各给药组存活率显著上升(P<0.01或P<0.05)，初步说明参麦方对糖脂毒性损伤的心肌细胞具有改善作用。见表4。

2.3形态学观察H9C2细胞凋亡 正常对照组细胞核有序匀称排布，核边缘柔和光滑散发淡蓝色光；与正常对照组比，糖脂模型组核大小不一，可见较多固缩，部分细胞核成片状分开，胞核染色加深，可见明显玻珠样病变；与糖脂模型组相比，各给药组细胞核玻珠样病变减弱呈淡蓝色光，核收缩情况缓解，说明糖脂毒性可能诱导细胞凋亡，经参麦方含药血清干预后可改善细胞凋亡。见图1。

2.4H9C2细胞的PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达检测 与糖脂模型组相比，各给药组PI3K、p-AKT/AKT蛋白明显升高，p-mTOR/mTOR蛋白表达显著降低(P<0.01或P<0.05)；说明参麦方含药血清可能调控了PI3K/AKT/mTOR通路。见表4、图2。

表4 参麦方对糖脂毒性模型存活率、PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及凋亡蛋白表达的影响

图1 参麦方含药血清Hoechst33258染色后H9C2细胞生长状态(×200)

2.5H9C2细胞的Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达检测 与糖脂模型组相比，各给药组抗凋亡蛋白Bcl-2显著升高(P<0.05，P<0.01)，促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase3表达水平显著下降(P<0.05，P<0.01)，说明参麦方含药血清可减缓心肌细胞凋亡，改善心肌功能。见表4、图3。

1～5：正常对照组，糖脂模型组，参麦注射液组，参麦方低剂量组，参麦方高剂量组；图3同图2 参麦方含药血清对H9C2细胞糖脂毒性模型PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达

图3 参麦方含药血清对H9C2细胞糖脂毒性模型凋亡蛋白表达

3 讨 论

T2DM是一种代谢紊乱性疾病，与年龄的影响有着不可分割的关系，年龄的增长导致糖尿病高发，对于老年人生活习惯干预可减缓糖尿病前期发展〔4〕，但未能解决根本问题，因此需探求天然药物讨论其作用机制减缓糖尿病的产生和发展。因此本文从糖脂毒性角度出发，对参麦方改善糖脂损伤对心肌细胞的影响进行探究。

目前最为公认的使细胞造成脂毒性损伤应用最广泛的分子是棕榈酸〔5～12〕，因此本研究中给予棕榈酸酯和葡萄糖刺激，建立心肌细胞糖脂损伤模型，通过细胞毒CCK8检测存活率，并通过形态学染色观察细胞凋亡情况，最终发现经参麦方干预后心肌细胞凋亡减少。而心肌细胞受损的同时发生的多种特征不仅包括细胞凋亡和坏死，还包括自噬。自噬和凋亡之间的平衡维持体内平衡。自噬的失活可能导致异常蛋白质和细胞器积聚，从而促进细胞凋亡或坏死。 所以自噬和凋亡在心肌细胞生长过程扮演重要作用〔13〕。研究发现，在中药活性成分干扰下能使心脏组织PI3K蛋白上调，从而激活PI3K/AKT通路，达到对糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用，其下游mTOR蛋白磷酸化可影响细胞自噬凋亡等生物活动〔14,15〕，Bcl-2是抗凋亡蛋白,Bax是促凋亡蛋白，这两个蛋白可互相协同发挥作用，对心肌细胞凋亡起着决定性作用,Caspase3是凋亡执行因子之一，是凋亡通路的必经途径，活化的Caspase3被激活可导致心肌细胞凋亡,三者对T2DM状态下造成的心脏损伤引起的心肌细胞凋亡有着关键作用〔16,17〕。参麦方是中国传统的中药复方，具有很好的抗凋亡作用，但是参麦方抗凋亡作用的机制尚不明确。因此通过参麦方干预后对大鼠心肌细胞进行蛋白检测，结果发现与模型组比较，各给药组PI3K、AKT/p-AKT蛋白上调，p-mTOR/mTOR蛋白下调，同时发现与模型组比较，各给药组促凋亡蛋白下调，抗凋亡蛋白上调。

综上所述，参麦方可能通过调控PI3K/AKT/mTOR 通路促进自噬产生从而抑制凋亡，改善心肌细胞损伤，从而起到对糖脂毒性损伤的心肌细胞保护作用，也为后续深入研究参麦方影响心肌细胞自噬和凋亡的作用机制提供理论依据。