HMGB1/PTEN通路对造血干细胞功能影响的体外实验

李成龙 周华 黄娟 王文 肖蓉

(四川省医学科学院 四川省人民医院血液内科，四川 成都 610072)

造血干细胞(HSCs)是血液系统中的成体干细胞，主要存在于脐血、胎盘、骨髓等组织中，具有自我更新和分化成各类成熟血细胞的能力〔1〕。HSCs移植已应用到临床造血系统疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等多种疾病的治疗，具有良好的应用效果，但其仍存在来源有限、移植失败等问题〔2〕。研究HSCs维持稳态、自我更新和定向分化的机制，对于临床治疗具有重要意义。高迁移率族蛋白(HMG)B1是一种由免疫细胞分泌的DNA结合蛋白，可以通过多种机制诱导单核/巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞等释放细胞因子〔3〕。张力蛋白同源物(PTEN)是一个抑癌基因，可以维持造血干细胞的静息状态，在维持造血发育中具有重要作用〔4〕。已有研究显示〔5，6〕，HMGB1可以上调PTEN的表达，还可以促进HSCs的增殖、分化和迁移，但其对HSCs的作用机制目前尚不清楚。因此，本研究通过一系列体外实验，探索了HMGB1/PTEN通路对HSCs功能的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料和仪器 CO2培养箱、全自动酶标仪购自Thermo Scientific公司；流式细胞仪购自美国FASCAN Becton Dickison；CD34+细胞选择试剂盒、MiniMACS磁珠分选系统购自德国Miltenyi Biotech公司；淋巴细胞分离液购自上海源叶生物科技有限公司；转染试剂HMGB1 siRNA、非特异性的siRNA(NS siRNA)均购自美国Santa Cruz Biotechnologieso；CCK-8检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；促红细胞生成素(EPO)和促血小板生成素(TPO)购自上海信裕生物科技有限公司；重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子购自上海江莱生物科技有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术公司；β-actin鼠单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体、HMGB1、PTEN、转化生长因子(TGF)-β1、p21和细胞周期素依赖激酶(CDK)4均购自美国Abcam公司。骨髓血样本由四川省医学科学院·四川省人民医院血液内科采集，来源于身体健康的骨髓供体，年龄<60岁，无遗传病史，经供体及其家属知情同意，经医院伦理委员会通过。

1.2细胞分离培养与鉴定 采用免疫磁珠分选法分离人HSCs细胞〔7〕，无菌采集骨髓血20 ml，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，离心(2 000 r/min，20 min)，吸取中间白膜层，重悬，加入5倍体积的红细胞裂解液，离心(1 200 r/min，5 min)，重悬，采用磁珠细胞分选免疫磁性吸附柱分离装置，常见标志物CD34+分选HSCs。

1.3细胞处理与分组 将HSCs细胞分为对照组和HMGB1 siRNA组。取对数生长期HSCs细胞用于实验，HMGB1 siRNA组转染HMGB1 siRNA质粒，对照组转染NS siRNA。采用RT-PCR检测转染效率，取各组HSCs细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，经反转录合成cDNA，进行RT-PCR，HMGB1引物序列：上游5′-GCTCCCATAGAGTACACCGGG-3′，下游5′-CCTCATCCTTGAACTTCGT-CGC-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。体系：95℃预热5 min，95℃变性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环，以GAPDH为内参计算HMGB1的相对表达量。

1.4Western印迹检测HMGB1、PTEN、TGF-β1、p21和CDK4蛋白的表达 收集各组HSCs，采用细胞裂解液裂解，提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量，取50 ng蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温封闭2 h，采用TBST洗膜并加一抗，于4℃孵育过夜，TBST洗膜加二抗，于室温下孵育2 h。再用电化学发光(ECL)显示，收集影像，用凝胶图象处理系统分析对比条带强弱，选用β-actin作为内参。

1.5CCK-8法检测HSCs的增殖活性 取各组HSCs细胞100 μl以2×103个细胞加入96孔板中，于37℃，5% CO2培养箱中孵育，分别于1、2、3、4 d进行细胞活性检测，每孔分别加入10 μl CCK-8 溶液，继续培养4 h，采用酶标仪分别检测450 nm波长的吸光度值(A450)。

1.6流式细胞仪检测HSCs细胞周期 收集两组HSCs，加入1 ml 70%冷乙醇固定1 h，离心，加入0.5 mg/ml的RNase处理，37℃孵育1 h，一次加入10 μl碘化丙啶(PI，10 μg/ml)混合，避光孵育30 min，上流式细胞仪进行检测细胞周期，ModFit LT分析并拟合计算各时期细胞百分比。

1.7流式细胞仪检测HSCs细胞凋亡 采用膜联蛋白(Annexin)V/PI双标记法检测细胞凋亡，收集各组HSCs，依次加入5 μl Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)和5 μl PI染色液混匀，室温避光孵育15 min，上流式细胞仪进行检测。

1.8HSCs细胞体外集落形成能力 收集各组HSCs 1×105个/ml，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次。采用甲基纤维素法检测红系祖细胞(CFU-E)，体系：30%小牛血清白蛋白，0.9 g/L甲基纤维素，0.1 μmol/L二巯基乙醇，3% L-谷氨酰胺，1 U/ml EPO；粒-巨噬系祖细胞(CFU-GM)体系：30%小牛血清白蛋白，0.9 g/L甲基纤维素，20 μg/L重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子；巨核系祖细胞(CFU-MK)体系：40 ng/ml白细胞介素(IL)-3、IL-6、TPO，0.05 μmol/L二巯基乙醇；多向造血祖细胞(CFU-Mix)体系：40 ng/ml IL-3、IL-6、TPO，20 μg/L重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子，1 U/ml EPO，0.05 μmol/L二巯基乙醇，3% L-谷氨酰胺，于37℃，5% CO2培养箱中培养。倒置显微镜下记录集落数，CFU-E：集落为8～50个细胞组成的细胞团，于第5～7天计数；CFU-GM：集落为≥40个的细胞团，于第7天计数；CFU-MK：集落为≥3个巨噬细胞，于第18天计数；CFU-Mix：集落为≥50个的细胞团(含红系、粒系、巨噬系/巨核系)，于第14天计数。

1.9统计学处理 采用SPSS17.0软件进行正态性检验、t检验。

2 结 果

2.1HSCs细胞HMGB1转染效率 与对照组(1.00±0.00)相比，HMGB1 siRNA组HSCs细胞HMGB1 mRNA的表达明显下调(0.32±0.02；t=83.283，P<0.001)。

2.2HMGB1缺失对HSCs细胞相关蛋白表达的影响 与对照组相比，HMGB1 siRNA组HSCs细胞HMGB1、PTEN和CDK4的表达明显下调(P<0.05)，TGF-β1和p21的表达明显上调(P<0.05)。见图1、表1。

图1 HMGB1缺失对HSCs细胞相关蛋白表达的影响

表1 HMGB1缺失对HSCs细胞相关蛋白表达及增殖能力的影响

2.3HMGB1缺失对HSCs细胞增殖能力的影响 与对照组相比，HMGB1 siRNA组HSCs细胞不同时间点的增殖能力均明显下降(P<0.05)。见表1。

2.4HMGB1缺失对HSCs细胞周期的影响 与对照组相比，HMGB1 siRNA组HSCs细胞G0期细胞明显减少(P<0.05)，G1期细胞明显增加(P<0.05)。见表2。

2.5HMGB1缺失对HSCs细胞凋亡的影响 与对照组相比，HMGB1 siRNA组HSCs细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。见表2、图2。

2.6HMGB1缺失对HSCs细胞集落形成能力的影响 与对照组相比，HMGB1 siRNA组HSCs细胞的CFU-E、CFU-GM、CFU-MK和CFU-Mix集落形成能力均明显下降(P<0.05)。见表2。

表2 HMGB1缺失对HSCs细胞周期、凋亡、集落形成能力影响

图2 HMGB1缺失对HSCs细胞凋亡的影响

3 讨 论

HSCs具有自我更新和分化能力，可以分化为造血祖细胞并最终生成各种血液细胞〔8〕。维持HSCs数量和功能的稳定对于预防造血系统损伤和血液系统疾病具有重要意义〔9〕。HMGB1是一种炎症相关的损伤分子，近年来研究显示〔10〕，HMGB1可以调节某些干细胞功能，诱导其增殖分化。PTEN基因编码产物为脂质磷酸酶，PTEN基因缺失可以激活TGF-β信号通路，抑制HSCs的自我更新，引起HSCs衰竭，甚至转化为白血病细胞〔11〕。已有研究显示〔12〕，阻断HMGB1可以抑制PTEN的活性，上调TGF-β1的表达，参与HSCs调控。本研究结果提示HMGB1可以上调PTEN的表达，下调TGF-β1的表达。TGF-β1属于TGF-β家族，可以激活下游的Smad，参与调控HSCs的功能。已有研究显示〔13〕，PTEN可以抑制TGF-β1信号通路，在HSCs的调控中具有重要作用，提示HMGB1缺失可能通过抑制PTEN的表达，激活TGF-β1信号通路参与调控HSCs的自我更新和定向分化能力。

本研究中，HMGB1缺失可以明显抑制HSCs细胞的增殖，诱导HSCs细胞周期阻滞，提示HMGB1在HSCs细胞增殖的调控中具有重要作用。临床研究显示〔14〕，TGF-β1对HSCs具有广泛的调节作用，TGF-β1/Smad信号通路的过度激活可以抑制HSCs的活性，从而抑制HSCs的增殖，影响其分化能力。Vaidya等〔15〕的研究显示，TGF-β可以下调CDK4的表达，将细胞周期阻滞于G1/S检查点，使细胞停滞于G1期，从而抑制HSCs细胞增殖，提示HMGB1缺失可能通过抑制PTEN的表达，激活TGF-β1信号通路，诱导细胞周期阻滞。本研究结果提示HMGB1缺失可能通过抑制PTEN的表达，激活TGF-β1信号通路，上调p21的表达，下调CDK4的表达。CDK4是细胞周期蛋白，与细胞周期蛋白协同作用，共同调控细胞周期进程〔16〕。p21是细胞周期抑制因子，可以抑制CDKs复合物活性，抑制HSCs的细胞周期〔17〕。Wang等〔18〕的研究显示，阻断HSCs的TGF-β1信号通路后，p21的水平显著下调，CDK4的表达显著上调，细胞增殖能力明显升高，提示HMGB1缺失可能通过抑制PTEN的表达，激活TGF-β1信号通路，作用于下游细胞周期相关靶蛋白，诱导细胞周期阻滞。本研究中，HMGB1缺失可诱导HSCs细胞凋亡。Blank等〔19〕的研究显示，TGF-β1信号通路可以参与调控HSCs的增殖、分化和凋亡，抑制HSCs的自我更新能力，提示HMGB1可能通过抑制PTEN的表达，激活TGF-β1信号通路，抑制HSCs的增殖，诱导细胞凋亡，抑制HSCs的自我更新能力。

本研究中，HMGB1缺失均可以明显抑制HSCs的CFU-E、CFU-GM、CFU-MK和CFU-Mix。CFU-E、CFU-GM、CFU-MK和CFU-Mix分别反映了HSCs分化为红细胞、中性粒细胞、巨核细胞和多向造血祖细胞的能力〔20〕，提示HMGB1缺失可以抑制HSCs定向分化为成熟血液细胞的能力。Li等〔21〕的研究显示，PTEN可以激活HSCs，提高HSCs的定向分化能力，与本研究结果基本相符，提示HMGB1缺失可能通过下调PTEN的表达，抑制HSCs的定向分化能力。Hinge等〔22〕的研究显示，TGF-β1信号通路的激活可以使HSCs维持在静息状态，抑制其进入细胞周期，抑制CFU-E、CFU-GM、CFU-MK和CFU-Mix集落的数目和体积，与本研究结果基本相符，提示HMGB1缺失可以抑制HSCs定向分化为成熟血液细胞的能力。

综上，HMGB1缺失可能通过抑制PTEN的表达，激活TGF-β1信号通路，抑制HSCs的增殖，诱导细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡，抑制HSCs的自我更新和定向分化能力。但本研究仅探索了体外HMGB1/PTEN信号通路对HSCs功能的影响，HMGB1/PTEN信号通路对体内HSCs功能的影响有待于下一步研究探索。