环介导恒温扩增芯片法在机械通气患者下呼吸道病原体检测中的应用

刘佳佳 孙静娜 闫海洋 韩振刚 陈静 赵帅

河北医科大学第一医院检验中心，河北石家庄 050031

机械通气患者病情危重，机体抵抗力明显下降，尤其是有创机械通气，极易发生院内肺部感染，如何在短时间内获取病原微生物的信息广受关注。传统培养法需要3～5 d 获得目标菌和药敏结果，环介导恒温扩增芯片法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作为一种新型检测技术，无需高温变性、低温退火过程，可在2 h 内完成常见下呼吸道病原菌及耐药基因检测[1-2]。恒温扩增芯片采用环介导恒温扩增技术与微流体芯片技术相结合设计而成的芯片，可同时检测多种耐药基因，针对性和特异度良好、灵敏度高、操作简便[3-4]。恒温扩增芯片法技术核心主要在于等温扩增、微流控芯片和实时荧光检测[5-6]。其中，等温扩增技术可帮助有效简化仪器操作，大幅度加快检测速度[7-9]。微流控芯片技术则主要保障反应微腔体物理分隔良好，避免相互污染，且使用一次性、封闭反应微腔体，可以有效杜绝核酸扩增产物的污染以此保障恒温扩增可以便捷高效地进行[10-12]。实时荧光检测技术灵敏度极高，结合人工智能判读软件，可自动计算判定结果，缩短检测周期[13-14]。本研究对恒温扩增芯片法检测经气管插管机械通气患者下呼吸道病原体及耐药基因的情况进行评价。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2021 年1 月至6 月90 例新转入河北医科大学第一医院呼吸内科及重症监护室行经气管插管机械通气合并通气后下呼吸道感染患者肺泡灌洗液标本。其中男62 例，女28 例；年龄16～95 岁，平均（63.42±7.21）岁。纳入标准：合并咳嗽、咳痰及肺部湿啰音，经胸部CT 或胸部平片检查证实存在下呼吸道感染，且经气管插管吸痰，以白细胞数＞25×109个/低倍视野，且上皮细胞＜10 个/低倍视野为标本合格。排除标准：合并病毒性肺炎；合并肺部真菌感染；肺结核；标本不合格。标本合格标准：多形核白细胞＞25×109个/低倍镜视野，鳞状上皮细胞＜10 个/低倍镜视野。

1.2 主要仪器和试剂

iChip-400 多通道核酸检测系统（天津百康芯公司）；呼吸道病原菌核酸检测（恒温扩增芯片法）试剂盒（成都博奥晶芯生物科技有限公司，批号：202002031）；全自动细菌鉴定药敏仪（迪尔96-Ⅱ）；Megafuge ST1R Plus 离心机（美国Thermo 公司，离心半径为10 cm）。

1.3 检测方法

所有患者均经气管插管吸痰取肺泡灌洗液标本；所有样本均分为两份，一份加入等量4%NaOH，混匀后室温液化，采用试剂盒行核酸提取，以恒温扩增芯片法检测耐药基因，随后按照核酸扩增反应体系，进行核酸靶序列扩增及检测。于检测页面中录入样本信息，根据软件设计对荧光数据进行处理分析，采用ROC法计算待测指标参考值。另一份行细菌培养，于采样后2 h 内进行血平板和巧克力平板接种，35℃、5%二氧化碳恒温箱孵育48 h 后，使用自动细菌鉴定药敏仪进行鉴定及药敏检测。

1.4 观察指标

根据芯片反应池分布情况，分析患者耐甲氧西林葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌属、嗜肺军团菌、肺炎链球菌、肺炎衣原体、肺炎支原体等病原体检出情况；同时分析KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48/23、mecA、VanA、VanB 等耐药基因检出情况；比较环介导恒温扩增芯片法与药敏试验匹配情况。

样本检测符合率情况分析：若样本检测耐药基因阳性，且同时细菌培养结果提示该样本对此耐药基因相应药物耐药，则提示两者检测结果符合；若样本检测耐药基因阳性，但细菌培养或药敏试验结果显示该样本对此耐药基因相应药物敏感，或细菌培养、药敏试验显示样本对耐药基因相应药物耐药，但样本检测结果显示耐药基因阴性，则记为检测结果不符合[15-17]。

2 结果

2.1 环介导恒温扩增芯片法病原体检测情况

共检测标本90 例，环介导恒温扩增芯片法检测阳性标本69 例，标本阳性率为76.67%。未检出卡他莫拉菌属、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、肺炎支原体。见表1。细菌培养法检测标本阳性31 例，标本阳性率为34.44%。嗜麦芽窄食单胞菌、卡他莫拉菌属、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、肺炎支原体未检出。见表2。

表1 不同方法病原体检测情况[例（%）]

2.2 环介导恒温扩增芯片法耐药基因检测情况

本药敏试验主要针对KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48/23、mecA、VanA、VanB 这8 种耐药基因进行检测，其中KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48/23 为耐碳青霉素类耐药基因，OXA-23 曾被作为某些肠杆菌治疗的首选药物，OXA-48/23 均是导致细菌耐碳青霉素类耐药的主要原因；mecA 为耐甲氧西林葡萄球菌标志性基因，耐甲氧西林葡萄球菌耐药性极强，一般情况下认为检出mecA 即为耐甲氧西林葡萄球菌阳性；VanA为耐万古霉素及替考拉宁类耐药基因，VanB 则为耐万古霉素类耐药基因，其中VanA 和VanB 为肠球菌中检测的耐药基因。环介导恒温扩增芯片法耐药基因阳性检出率为86.67%（78/90），其中mecA、OXA-48、OXA-23 为检测率最高的3 种耐药基因。见表2。

表2 环介导恒温扩增芯片法耐药基因检测情况

2.3 细菌培养法耐药基因检测情况

细菌培养法标本阳性31 例，耐药试验检测耐药频率最高依次为碳青霉素类、青霉素类、万古霉素类、替考拉宁类。见表3。

表3 细菌培养法耐药基因检测情况

2.4 环介导恒温扩增芯片法与细菌培养符合情况分析

以每个样本为单独整体，分析环介导恒温扩增芯片法耐药基因检出情况与细菌培养法药敏试验耐药情况，环介导温扩增芯片法在mecA、OXA-48、OXA-23 等耐药基因的检测上具有较高检出率，且与耐药检测金标准符合率高，在耐甲氧西林葡萄球菌耐药基因mecA 和耐碳青霉素耐药基因OXA-48/23 检测中，符合率可达100%。

3 讨论

细菌培养和药敏试验一直以来都是检测病原体耐药性的金标准，但其在检测灵敏度、检测周期等方面往往难以满足临床工作的需求，且其可检测的耐药基因较为单一[18-20]。近年来，随着分子检测技术的不断发展，耐药基因检测应用日益广泛，能同时检测多个病原体和耐药基因，且特异度高的检测技术，成为临床需求的首选。

LAMP 对减少呼吸机相关性肺炎的发生，防止多重耐药菌传播，指导临床合理用药具有重要的指导意义[21]。为明确恒温扩增芯片法技术在机械通气下呼吸道感染患者病原体及耐药基因检测中的应用，在保障样本不受上呼吸道菌群及口腔菌群的污染下[22]。本研究结果显示，恒温扩增芯片法病原体阳性标本69 例，阳性率为76.67%，下呼吸道分泌物样本中细菌培养阳性率（34.44%）明显低于恒温扩增芯片法，其检出病菌31 株，检出率最高前6 位分别为鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌，与既往研究[23]中重症监护室细菌种类及分布情况相近。恒温扩增芯片法检出的病原菌分布与细菌培养法有一定差异，国内其他通过细菌培养法研究下呼吸道感染的研究多以铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等为主要致病菌，猜测恒温扩增芯片法和细菌培养法的检测差异可能与细菌培养法的实验室检测条件受限有关，提示恒温扩增芯片法对于反映机械通气合并下呼吸道感染真实性更高[24-25]。

本研究环介导恒温扩增芯片法阳性检出率为86.67%，其中mecA、OXA-48、OXA-23 检测率最高，在本研究中未行肠球菌检测，故VanA 和VanB 检出率为0。王咏红等[26]研究指出，以细菌培养法为金标准，采用芯片法测出的很多阳性患儿会被判定为假阳性，导致芯片法的特异性低，采用细菌培养法作为金标准评判芯片法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值会存在误差。基于此，本研究采用两种不同方法进行耐药基因检测，结果显示，恒温扩增芯片法对常规耐药基因的阳性检出率明显高于传统药敏检测，且部分样本存在两个和/或两个以上耐药基因阳性情况。一方面提示恒温扩增芯片法对于耐药基因检测敏感性高，特异性强，一方面也提示临床抗菌用药，需要考虑联合感染并慎重给药。以每个样本为单独整体，分析恒温扩增芯片法耐药基因检出情况与细菌培养法药敏试验耐药情况。结果显示，温扩增芯片法耐药基因阳性检出率为86.67%（78/90），且其在mecA、OXA-48、OXA-23 等耐药基因的检测上均具有较高检出率，与此同时，细菌培养法药敏试验结果显示，样本耐药频率最高依次为碳青霉素类、青霉素类、万古霉素类，上述3 类耐药基因相应抗生素在临床上也是最常用于抗感染治疗的药物，其相关药物是否耐药对于指导临床抗生素的正确使用具有积极意义。其中碳青霉素类药物出现频率在40%以上，与耐药基因检出结果比较，耐药检测金标准符合率高，但对于耐药基因数量及耐药性的检测还有待进一步实验分析。

与传统细菌培养法比较，恒温扩增芯片法对于检测机械通气合并下呼吸道感染患者分泌液病原体具有高阳性检出率，其耐药基因检测特异性好，对于指导临床药物干预具有积极作用。