茶叶中咖啡碱提取的方法分析

孟祥玉，许 龙，宋晓梅

（佳木斯大学 生命科学学院，黑龙江 佳木斯 154007）

咖啡因浓度作为判断茶叶质量的主要因素，其对测试茶叶质量具有至关重要的作用，尤其在信息化时代背景下，我国咖啡因浓度检测方式趋于多样化，如紫外分光光度法、薄层色谱法等，其中相色谱法凭借自身高效性、高灵敏度等特点，被经常应用在茶叶咖啡因检测当中。而从茶叶中提出咖啡碱最常用的方法有二氯甲烷有机溶剂提取法和醇提法两种，而醇提法是通过利用乙醇溶液和提取器来提取咖啡因，或利用热度进行加热，通常前面提取方式往往要耗费2-3小时，需要耗费较长时间，后者需要应用大量二氯甲烷、丙酮、三氯甲烷等有机药剂，这种药剂会对人体与环境造成严重污染，且需要经过水浴回收、蒸馏、抽滤等过程，不利于日常检测。虽然我国政府部门利用合理随便对样品处理过程进行升级，将水作为溶剂的替代品，利用氧化镁来检测茶叶中单宁酸元素，但由于整个处理过程十分复杂，往往要利用沸水处理两次，且要不定期摇晃，需要耗费大量时间，操作步骤十分繁琐，提取率很低。针对以上这些问题，为了提高提取率、缩短操作步骤，对提取方式进行了优化。用70%乙醇溶液做主体，对其进行加热、超声提取、微波萃取等，来提高提取效果，并对测试莱芜干烘茶中咖啡碱的高效液相色谱法进行优化，为后续研究打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

LTB-800数控超声波清洗机主要生产在济宁鲁通超声电子设备公司；而TDZ5-WS离心机是出厂于湖南湘仪实验仪器开发有限公司；SHA-C水浴恒温振荡器，江苏金怡仪器科技有限公司；U3000高效液相色谱仪；日本岛津公司UV-2700紫外可见分光光度计。同时咖啡因标准品≥99.8%，；无水乙醇、甲醇、乙腈、氧化镁（分析纯）、莱芜干烘茶、测试用水为娃哈哈纯净水。

1.2 液相色谱条件

流动相：甲醇-水比例25∶75，V/V；检测波长275mm；色谱柱acclaim120c18；柱长度4.6mmX150mm，直径5um；流动相流速1ml/min；柱温30°。

1.3 干烘差样品处理

当工作人员将干烘茶放在低温环境下进行干燥粉碎后，要将其放在孔径为0.600mm的孔径筛内，将所提炼出来的氧化镁与茶叶样品放入在微波萃取管和三角瓶当中，然后在三角瓶中添加不同剂量的乙醇溶液，再将这些溶液进行搅拌，等到所有溶液全部搅拌均匀后，可采用加热的方式进行提取，或者可利用超声提取、微波萃取等方式来提取茶叶中蕴含的咖啡碱成分。将会得到大量的提取液，将全部提取液放置在瓶中，再用纯净水进行定容，经过有机相针式过滤器后在进行测试。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的研究分析

2.1.1 检测器波长确定。在正常情况下，工作人员根据行业要求，将咖啡碱溶液利用紫外分光光度计来进行扫描，再合理利用扫描数据来制作吸收曲线，帮助工作人员发现咖啡因的最长吸收波长（如图1所示）。从吸收曲线图可见，在咖啡因280mm左右，所吸收波涨幅达到最高点。由于在最大吸收波长条件下检测，所具有的杂质最少，让其具有较好的稳定性与灵敏性，从而将275mm作为测定波长。

图1 咖啡碱标准品溶液吸收曲线

2.1.2 流动相组成及比例确定。经过有关人员研究发现，乙晴和甲醇两种物质与不同体积水相融合，当其逐渐流动时，很容易给杂质峰和目标峰带来不同程度的影响，经过有关人员分析发现，在有机环境下杂质峰和目标峰分离状态能达到预期标准，且峰形能满足实际需求。但由于在研究过程中发现甲醇毒性较低，研究人员可将甲醇和水进行相互结合，形成全新的流动物质来进行流动。将甲醇与水根据不同体积比例对干烘茶提取液进行测试，这时甲醇与水的体积分为别10:90/20:80/25:75，而柱温为30°，紫外波长为275mm，经过实验发现，当两者体积比达到第一比例时，咖啡碱提取时间不会超过18min；当体积比在达到第二阶段时，咖啡碱提取时间下降到7min；当体积比达到第三阶段后，咖啡碱提取时间降低到5min内，并且体积比达到第三阶段后杂质峰和目标峰呈现分离状态，具有相同比例的色谱峰形状，给甲醇检测效率带来不同程度的影响。

2.1.3 确定色谱柱温度。经过大量实验证明，当色谱柱温度控制在40°—52°时，要严格遵循色谱条件进行检测，每隔5°要测试一次咖啡碱标准溶液。经过研究结果发现，在一定温度中柱温并不会给咖啡碱保留时间、色谱峰峰形带来严重；随着温度不断升高，很容易给会色谱柱寿命带来严重限制，甚至会有效降低各组分离度，经过专业人员实验发现柱温可控制在30°。

2.2 咖啡碱提取方法的优化选择

在信息化时代背景下，茶叶咖啡碱提取方式是根据提取溶剂不同使用不同的提取方法，如二氯甲烷提取法、醇提法、水提法等。按照提取方式不同可分为微波萃取、加热浸提、超声提取等方式。经过专业研究发现，利用乙醇溶液、水、二氯甲烷作为提取剂效果更好，但值得注意的是，要选择不同体积分数的乙醇溶液作为提取溶剂，并将直接加热浸提优化为加热振荡提取，将三种不同的提取法进行对比，选择一种性价比最高的提取方法。

2.2.1 加热振荡提取。加热振荡提取是现代应用范围较广的提取方式，其具有简单易操作特点。取0.5g莱芜干烘茶样品和5份氧化镁，将其放在5只100mL三角瓶当中，分别在这个瓶子内加入40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml的乙醇溶液，将其放入到恒温的振荡器中，由于在常规条件下的乙醇溶液沸点较低，为避免提取过程当中乙醇沸腾降低其功效，在提取时要控制温度，不宜过高，温度控制在80°左右。

2.2.2 超声提取。超声提取是利用超声波机械独特的性能，如粉碎功能、空化功能，提高提取速度，将其向溶剂四周拓展，能有效提高提取率。严格遵循行业标准进行称取重量，在干烘茶样品和氧化镁中添加乙醇溶液，在功率为200w，78°情况下，利用超声波来提取60min。

2.2.3 微波萃取。微波萃取技术是一种新型的提取技术，其具有试剂用量少、萃取时间短、节能高效等特点，已被普及到生物样品分析、食品分析等方面。在国家政策当中有明确表明，在茶叶提取实验当中，我们应该通过化学实践，自己准备实验药品、实验装置，亲自实验，才能明白干烘茶艺之间的反应，明白提取法在干烘茶里面的重要意义，让我们在实验当中学到实际知识、提升我们的动手能力。这种萃取方法是以CEM微波化学技术作为基础，再结合其他文献进行优化，称取0.5g粉碎干烘茶样品和5份1g氧化镁，分别放置在5个萃取管内，分别在这个瓶子内加入40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml的乙醇溶液，研究人员要严格根据方法1进行萃取。通过三种不同方法进行提取液将所有上清液用纯净水定容在50ml，经过有机相针式过滤器进行过滤，从而准确判断检测条件来确保提取液的顺利进行，如图4所示。

表1 微波萃取方法

从图2可见，提取方法和乙醇体积分数对咖啡因提取效果存在不同程度的影响。当茶叶样品基本数据相同时，乙醇体积分数在70%，研究人员可通过微波萃取方式来提高咖啡碱的质量；当乙醇体积为80%时，依旧利用微波萃法所得到的咖啡碱质量最高；当乙醇体积小于70%时，加热振荡法所产生的咖啡因质量最低。从以上数据可知，当乙醇溶液体积在70%时，微波萃取方法效果最好，其具有操作简单、用时最短的特征。

图2 提取方法及乙醇体积分数对咖啡碱提取效果的影响

2.3 咖啡因线性和方法检出限

将咖啡碱标准储备液制作成为六种不同质量浓度溶液，要根据测试条件来做出相应测试，经过统计测试结果发现，在这个范围内峰面积线性和质量浓度具有直接性关系（如图3所示）。曲线方程如表2所示。

如图3 咖啡因校正曲线图

如表2 校正曲线和检出限

2.4 方法精密度实验

在进行实验装置创新时，要以安全为主，保证实验时实验装置的安全性、稳定性，严格执行实验规范。比如在改良设备装置时，安装顺序应该是由左到右、由下到上，依次操作，实验的操作过程应该是按照设备——检查设备装置的密闭性——添加实验药品——进行实际操作。节约型原则在改进设计时非常重要，需要明白实验的要求，可以在实验课当中学到实际知识、提升动手能力，在实验当中尽可能的少用仪器以及药剂，简化实验步骤。比如在创新干烘茶装置时，可以采用取代的方式，避免实验过程中药剂的浪费（如表3所示）。

表3 咖啡因精密度实验结果

经过以上实验结果分析，在经过六次测量后，其相对标准偏差大概为0.46%，干烘茶样品当中的咖啡因平均值为23.85mg/g，通过数据我们不难看出，这种方法精密度较高，能应用于日常检测当中。

2.5 方法加标回收率的测定

称取茶叶样品在校正曲线范围内，加入不同量的咖啡因，并利用合理方式来进行测定（如表4所示）。

表4 加标回收试验结果

3 结论

通过对不同提取咖啡碱方法进行对比发现，经过离心过滤后能直接进行上机测试，与加热振荡提取相比，这种提取方式效率更高、更简单、耗时较少；与其他测试茶叶中咖啡碱的高效液相色谱法相比，这种方式的回收率更高、分析时间较少，检出限较高。符合政府部门检查要求，适合应用于莱芜干烘茶中，对测试咖啡因含量具有非常重要的作用。