改良剂调控盐碱胁迫对棉田土壤微生物多样性的影响

王晓丽，安梦洁，张春媛，樊华，王开勇

(石河子大学农学院,新疆 石河子 832003)

盐渍化土壤极大地限制了半干旱和干旱地区的作物生产[1];中性盐和碱性盐是农田盐渍土的主要成分,它们是既相关又有本质区别的非生物胁迫[2]。西北地区占全国总面积的71%，但西北地区的土壤70%为盐渍土[3]。土壤盐化主要是由于NaCl的积累，碱化主要是由于Na2CO3和NaHCO3的积累[4]。盐碱地被认为是生命的严酷栖息地，盐碱地中的微生物群落尤其重要，因为它们在生态系统过程中起着至关重要的作用，而土壤盐化和碱化会导致微生物群落结构遭到破坏，微生物多样性减少，从而破坏土壤环境[5]。因此，缓解土地盐碱化已经成为新疆农业开发及持续发展的重大任务。

高分子材料能够吸收和保持大量水分，增强土壤的保水能力，稳定土壤结构，因此，许多高分子土壤改良剂在农业和生态修复土壤中应用[6]。高分子土壤改良剂的应用可以改善土壤微生物群落结构[7]，但它对土壤理化性质和土壤微生物生态系统的影响尚不明确。大量研究表明土壤微生物群落受各种环境因素的影响，包括土壤pH值、电导率(EC)和盐度等多种环境因素的影响[8-10]。因此，研究分析高分子土壤改良剂对改良盐化和碱化土壤中微生物的分布及多样性的影响，可以提高对高分子土壤改良剂在改变土壤理化性质和土壤细菌群落等的认识，进而有利于更有效地把盐碱土逐步地修复为可利用土壤。

本文研究利用高分子土壤改良剂探究盐碱土中微生物群落结构的多样性，利用Illumina平台的测序技术分析盐碱土壤中微生物的群落结构，确定在盐化和碱化土壤中添加高分子土壤改良剂后土壤细菌群落和土壤理化性质的变化，明确土壤微生物群落是否随土壤性质的变化而变化，以及两种高分子改良剂对土壤细菌群落的影响。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验于2018年在新疆石河子市葡萄研究所进行。供试土壤为灰漠土，土壤基本理化性质为pH 7.72，CEC 17.32 mol/kg;土壤有机质12.5 g/kg，碱解氮、速效磷、速效钾分别为54、11.7、218 mg/kg。

1.2 试验设计

试验采取桶栽控制试验，供试品种为棉花。根据前人研究及预验的结果，在试验地桶(直径50 cm，高60 cm)内土壤中人为添加中性盐(NaCl)和碱性盐(Na2CO3)，使土壤盐碱含量达8 g/kg，充分混匀后，将桶埋回大田中，以保持大田群体效应。处理后盐化土壤的pH值为8.24，碱化土壤pH值为9.78。

试验共设置6个处理，均进行常规施肥，其中4个是添加改良剂的处理，分别为OP-S(盐胁迫+有机高分子复配材料)、FA-S(盐胁迫+以黄腐酸为主的复合材料型)、OP-A(碱胁迫+有机高分子复配材料)、FA-A(碱胁迫+以黄腐酸为主的复合材料型)]，2种改良剂均为自主研发，其余2个为对照处理，分别为S(盐胁迫)和A(碱胁迫)。采用完全随机区组试验设计，每处理重复3次。于2018年5月播种，出苗后定苗；于6月25日第1次灌水，灌水周期为10 d，全生育期共灌水9次；2种改良剂每次随水施加，2018年10月初收获。

表1 试验处理

1.3 取样与测定

1.3.1 取样

在棉花花铃期采集土壤样品，先将棉花根系从土壤中挖出，轻轻地抖掉根系周围松散的土壤，然后将附着在根表面的土壤作为根际土壤进行收集。将土壤样品密封在一新塑料袋内后放入冰盒中，每个小区采3点混合并用“四分法”获得1个土样。一部分土样自然风干后过2 mm筛，保存备用于测定土壤pH、EC值、K+、Na+的含量；另一部分过2 mm筛进行彻底均匀化，置于-80 ℃冰箱中储存，用于土壤细菌群落多样性的测定。

1.3.2 土壤微生物总DNA的提取

采用DNA提取试剂盒提取土样DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的长度和完整性。所有样品基因组DNA提取和16S rDNA扩增与测序工作委托北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.3.3 高通量测序

采用通用引物对土壤细菌16S rRNA基因的V3至V4区扩增，通过HiSeq 2500 PE250(Illumina公司，美国)进行高通量测序。

1.3.4 土壤理化性质的测定

以水土质量比5∶1制备土壤水浸提液，并用于土壤pH和盐分指标的测定，土壤pH用通用型pH计 (OHAUS Starter 3C,美国)测定，电导率(EC)用电导率仪 (OHAUS Starter 3C,美国)测定[11]。

1.3.5 土壤钾钠离子含量的测定

参照鲍士旦的方法[11]采用火焰光度法测定K+、Na+含量。

1.4 数据处理及分析方法

数据处理采用Excel 2013软件；采用SPSS 17.0进行描述性统计和方差分析，其中方差分析选择单因素方差分析(One-way ANOVA)；图表绘制采用Excel 2013、Origin2018和RStudio。对物种之间的生物网络关系进行网络图表达物种的相关性分析，根据盐、碱处理下各个物种的丰度以及在样品中的变化情况，使用Sparcc算法进行相关分析(包括正相关和负相关)，筛选出相关性大于0.1且P值小于0.05的数据组进行统计检验，再筛选出相关性最高的属，基于python绘制表达分析网络图。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

从表2可以看出：盐碱胁迫下，与对照(S、A)相比，添加改良剂后土壤的pH、EC均降低，碱胁迫下土壤pH均显著大于盐胁迫。盐胁迫下，与对照(S)相比，OP-S和FA-S处理土壤的pH分别降低5.55%(P>0.05)、2.85%(P>0.05)，EC值分别降低9.32%(P>0.05)、12.43%(P>0.05)。碱胁迫下，与对照(A)相比，OP-A和FA-A处理的土壤pH分别降低1.60%(P>0.05)、1.10%(P>0.05)，EC值分别降低16.90%(P>0.05)、8.10%(P>0.05)。

表2 不同处理下土壤pH和EC值

2.2 土壤钾钠离子

从图1可以看出：与对照(S、A)相比，添加改良剂(OP-S、FA-S、OP-A、FA-A)处理土壤的K+、Na+含量及K+/Na+比值均降低，并且各处理碱化土中Na+含量均显著高于盐化土，碱化土的K+/Na+比值均低于盐化土。盐胁迫下与对照(S)相比，改良剂(OP-S、FA-S)分别使土壤K+含量降低23.43%(P<0.05)、39.05%(P<0.05)，Na+含量分别降低了10.89%(P>0.05)、7.02%(P>0.05)；碱胁迫下添加改良剂(OP-A、FA-A)的处理与对照(A)相比，K+含量分别降低21.18%(P<0.05)、36.46%(P<0.05)，Na+含量分别降低了32.47%(P<0.05)、27.30%(P<0.05)(图1a)。盐胁迫下添加改良剂(OP-S、FA-S)的处理与对照(S)相比，土壤K+/Na+比值分别降低14.04%(P>0.05)、34.05%(P<0.05)；碱胁迫下添加改良剂(OP-A)的处理与对照(A)相比，土壤K+/Na+比值增加22.37%(P<0.05)，添加改良剂(FA-A)的处理与对照(A)相比降低12.51%(P>0.05)(图1b)。

图中小写字母表示同一指标分别在盐胁迫和碱胁迫不同处理间差异达到P<0.05显著水平。图1 不同处理下土壤K+、Na+的含量

2.3 盐碱胁迫对土壤细菌群落多样性影响

从表3可以看出：OP-S处理和OP-A处理下Chaol和ACE指数相对较高，说明群落丰富较高，总体上体现在添加改良剂OP后可使盐、碱处理的丰富度有所增加。从表3中Simpson和Shannon指数可以看出，群落多样性变化规律不明显，无法对群落多样性进行准确分析。

表3 不同处理土壤微生物多样性指数统计表

2.4 土壤细菌群落和结构

从图2可以看出：不同处理土壤细菌优势门类主要包括变形菌门(Proteobacteria)(27.76%～38.27%)、酸杆菌门(Acidobacteria)(12.64%～15.23%)、放线菌门(Actinobacteria)(8.3%～19.35%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(9.43%～14.94%)是根际土壤的优势菌群，相对丰度最高。其次是绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)，而浮霉菌门(Planctomycetes)、六核杆菌门(Rokubacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和其他一些未能分类鉴定的微生物类群都以较低丰度分布在土壤中。

酸杆菌门(Acidobacteria)在S处理中比OP-S、FA-S处理的都高，分别高出8.53%和3.17%，说明盐处理下不利于酸杆菌门的生长繁殖，而在碱胁迫下则相反。但对于放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)其在OP-S、FA-S处理下所占比例普遍高于S处理，而在碱胁迫下则相反。OP-A处理下变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)相对于A处理增加幅度分别为3.54%、2.12%、0.31%；FA-A处理下变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)相对于A处理增加幅度分别为9.79%、0.80%、0.75%。

图中一种颜色代表一个物种，色块长度(柱状图)；表示物种所占相对丰度比例。图2 改良剂对根际土壤微生物门水平群落组成

2.5 物种丰度聚类热图

基于OTU结果用不同颜色变化来表示分类信息和处理间差异，结果(图3)显示：

不同处理间差异较大，与S处理相比，OP-S处理中纤维杆菌门(Fibrobacteres)、装甲菌门(Armatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)丰度明显增加，而酸杆菌门(Acidobacteria)、WS2、六核杆菌门(Rokubacteria)丰度明显降低。与S处理相比，FA-S处理中蓝细菌门(Cyanobacteria)、广谷菌门(Euryarchaeota)、晚生菌门(Latescibacteria)丰度明显增加，而硝化螺菌门(Nitrospirae)、酸杆菌门(Acidobacteria)和WS2丰度明显降低。与A处理相比，OP-A处理中嗜热球菌(Deinococcus-Thermus)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)丰度明显增加，而放线菌门(Actinobacteria)丰度明显降低。与A处理相比，FA-A处理中大肠杆菌(Epsilonbacteraeota)、杆菌门(Patescibateria)丰度明显增加。

另外，从相似度可以看出，FA-A和OP-S处理可聚为一类，A和OP-A处理可聚为一类；FA-S处理在分支上位置较远，且FA-S处理与其余处理在颜色分布上差别较大。

综上可知：盐化处理下和碱化处理下的微生物聚集情况不相似。

图中颜色代表物种丰度;纵向聚类表示不同物种在各处理间丰度的相似情况，两物种间距离越近，枝长越短，说明这两个物种在各处理间的丰度越相似；横向聚类表示不同处理的各物种丰度的相似情况，与纵向聚类一样，2个处理间距离越近，枝长越短，说明这2个处理的各物种丰度越相似。图3 门水平物种丰度聚类热图

2.6 门水平物种生物网络图

由图4可知：盐处理下物种丰度最高的4个物种分别是放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)，筛选出相关性最高的26个门中表现正相关的线条有13条，表现负相关的线条有14条(图4a)。碱处理下物种丰度最高的4个物种分别是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，筛选出相关性最高的25个门中表现正相关的线条有14条，表现负相关的线条有18条(图4b)。

用节点代表物种，节点大小代表丰度；线条代表两物种间相关，黄色代表正相关，绿色代表负相关。图4 盐处理(a)和碱处理(b)的群落结构(门水平)物种生物网络图

2.7 土壤细菌多样性与土壤理化性质的关系

采用冗余分析方法(RDA)分析不同改良剂对土壤细菌群落多样性和土壤理化性质的影响，结果(图5)显示：土壤K+和K+/Na+比与浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺菌门(Nitrospirae)、酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度呈正相关，与拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度呈负相关，表明pH和K+/Na+比值对土壤微生物的影响最大。盐胁迫下添加改良剂(OP-S)的处理与疣微菌门(Verrucomicrobia)密切相关，添加改良剂(FA-S)的处理与浮霉菌门(Planctomycetes)密切相关；碱胁迫下对照处理(A)与放线菌门(Actinobacteria)密切相关，添加改良剂(OP-A)的处理与绿弯菌门(Chloroflexi)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)密切相关，添加改良剂(FA-A)的处理与拟杆菌门(Bacteroidetes)密切相关。同时，pH、EC和K+/Na+对Firmicutes的影响较大，K+对绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和浮霉菌门(Planctomycetes)的影响较大，K+/Na+比值对硝化螺菌门(Nitrospirae)和酸杆菌门(Acidobacteria)的影响较大。

图5 盐碱处理对棉花根际土壤理化性质与微生物群落(门水平)的冗余分析

3 讨论

3.1 改良剂的应用对土壤理化性质的影响

盐碱土壤中K+、Na+过多会对土壤结构造成不良影响，易使土壤板结[12]；土壤改良剂不仅能影响土壤中K+、Na+含量，也会影响K+、Na+从土壤向植株中转运。本研究结果表明碱胁迫对土壤中盐基离子造成的影响大于盐胁迫，另有研究发现添加外源腐殖酸类物质可以疏松耕层土壤,腐殖酸对钠离子、氯离子有很强的吸附作用，降低表层土壤的含盐量,达到调节土壤盐基离子含量，减轻土壤盐碱化的效果[13]。

刘璐等研究发现添加土壤调理剂能降低土壤中水溶性盐基离子的含量，有效改良盐化和碱化土壤[14]，另外，施用脱硫石膏可降低土壤中Na+和K+含量[15]；龙明杰等[16]采用磺化木质素和高分子材料复配能有效地改良碱土。本研究发现在盐胁迫和碱胁迫下添加改良剂可以降低土壤中K+和 Na+含量，可能是由于土壤中K+被根系迅速吸收运输，促进作物的营养生长和生殖生长，同时高分子材料中的Ca2+与土壤中Na+发生置换作用而造成Na+含量的降低。

此外，K+和Na+是与土壤EC值相关的主要可溶性盐[17]，与土壤pH和EC呈显著正相关[18]；本研究结果表明碱胁迫下土壤pH、EC值显著高于盐胁迫。为了调控盐碱胁迫对土壤造成的污染，通过向土壤中添加外源物质也可以改变土壤的理化性质，赵金星等[19]研究发现添加改良剂处理后土壤的电导率显著增加、pH值降低、土壤的物理性状明显改善；杨宇等[20]在盐碱土壤上添加以黄腐酸为原料制成的土壤调理剂进行改良试验，发现土壤pH值明显降低；本研究结果表明盐胁迫和碱胁迫下施用改良剂后土壤pH、EC值降低，说明改良剂有降低盐化、碱化土壤的作用，对盐化土的改良主要是降低土壤的EC值，对碱化土壤的改良主要是降低土壤的pH值。

3.2 改良剂的应用对土壤细菌群落结构和多样性的影响

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成，能促进土壤营养的转化，提高土体质量，但对土壤环境的变化极其敏感[21]。盐碱胁迫对微生物生长有抑制作用，造成微生物量减少[22]。罗俊等[23]试验研究发现高分子材料对土壤微生物群落的影响最明显，WU H P[24]等研究表明添加堆肥可提高细菌群落的丰度和多样性，本研究的结果与之相似。

众多研究发现土壤变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)通常是大多数土壤中最占优势的细菌门[25-27]。牛世全等[28]研究发现原生盐碱土的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)，次生盐碱土的优势菌门是放线菌门(Actinobacteria),且分布的细菌多嗜盐碱细菌。本研究结果表明6个处理拥有相同的优势菌群,分别是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和放线菌门(Actinobacteria)，说明在盐化和碱化环境下土壤细菌类群的分布具有一定的相似性，这与前人研究结果[29]一致；此外，在优势菌门中，有机高分子复配型改良剂和黄腐酸为主的复合材料型改良剂可提高盐胁迫下放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度，提高碱胁迫下变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度。

3.3 改良剂的应用对土壤理化性质和土壤微生物相关性的影响

盐碱土壤作为一种极端环境，其中的微生物具有不同于一般微生物的生理功能和特殊结构，并且这些微生物的生命活动决定了土壤的理化性质，会影响土壤结构和肥力[30]。同时，土壤pH和EC也是细菌群落多样性的首要影响因子，它是决定细菌群落组成、系统类型丰富度的主要因素，对土壤微生物生长和繁殖影响较大[18,31-32]。除土壤pH和EC之外，K+和Na+含量也对土壤细菌群落组成有重要影响[18]。刘师敏等[33]试验结果表明施用脱硫石膏处理下盐碱地土壤的pH值下降、微生物活性提高；HO A[34]等通过在土壤中添加有机质改变了土壤微生物群落的丰度、结构组成和生物交互作用。本研究冗余分析结果表明，土壤pH、EC和K+/Na+比值对Firmicutes、Nitrospirae和Acidobacteria细菌群落的影响最大，添加改良剂的处理与Planctomycetes、Chloroflexi、Verrucomicrobia、Bacteroidetes四种优势菌群的关系最密切，这与DEMOLING F等[35]研究结果一致。

上述研究结果说明改良剂的添加主要是对土壤的影响，进而对土壤微生物的群落结构造成影响。其原因可能是改良剂处理主要是通过提高土壤肥效、改变土壤pH、EC和降低盐碱化来改善微生物的生存环境，进而提高了土壤微生物多样性。

4 结论

(1)盐化和碱化土壤中施用高分子材料可以降低土壤理化性质，使得土壤微生物活性提高，其中，以黄腐酸为主的复合材料型改良剂对降低土壤K+的效果更显著，同时，以黄腐酸为主的复合材料型改良剂对土壤盐胁迫处理的影响大于碱胁迫处理的。

(2)通过向盐化和碱化土壤中添加两种改良剂有助于改善盐化和碱化土壤细菌群落多样性。盐胁迫下，不添加改良剂时酸杆菌门(Acidobacteria)丰度较高，平均含量达到19.10%；碱胁迫下，不添加改良剂时放线菌门(Actinobacteria)丰度较高。有机高分子复配型改良剂和黄腐酸为主的复合材料型改良剂使盐胁迫下放线菌门(Actinobacteria)丰度增加，平均比例高达14.40%和16.94%，并使碱胁迫下变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)丰度增加，其中变形菌门(Proteobacteria)丰度的平均比例分别高达31.76%和38.01%，酸杆菌门(Acidobacteria)丰度的平均比例分别高达15.05%和13.73%。