铁苋菜抗炎镇痛有效部位的筛选

梁生林，李庆耀，周细根

铁苋菜抗炎镇痛有效部位的筛选

*梁生林，李庆耀，周细根

（井冈山大学医学部，江西，吉安 343009）

筛选铁苋菜抗炎镇痛作用的有效部位，并初步探究其作用机制。采用热板和醋酸扭体疼痛模型，考察铁苋菜镇痛作用的有效部位，采用二甲苯致小鼠耳肿胀、蛋清致大鼠足跖肿胀以及大鼠棉球肉芽肿炎症模型，考察铁苋菜抗炎作用的有效部位。铁苋菜乙酸乙酯萃取部位明显延长热板所致小鼠痛阈值和明显减少醋酸所致小鼠扭体反应次数，与正常对照组比较和自身给药前比较差异显著（< 0.01）；明显抑制二甲苯所引起的小鼠耳肿胀和蛋清所引起的大鼠足跖肿胀以及棉球所引起的肉芽肿，与正常对照组比较差异显著（< 0.01）；明显减少醋酸所致疼痛小鼠血清PGE2、cAMP的含量，与正常对照组比较差异显著（< 0.01）；明显降低蛋清所致大鼠足跖组织NO、PGE2含量，与正常对照组比较差异显著（< 0.01）。铁苋菜抗炎镇痛作用的有效部位主要为乙酸乙酯部位，其镇痛作用机制可能与降低血清PGE2、cAMP的含量有关，其抗炎作用机制可能与减少炎症组织NO和PGE2含量有关。

铁苋菜；镇痛；抗炎；有效部位；作用机制

铁觅菜（L.）为大戟科铁觅菜属植物铁觅菜的干燥全草，别名血见愁、海蚌含珠、叶里含珠、痢疾草，分布于江西、安微、湖北、湖南、广东、广西、贵州等地。性凉，味苦、涩，具清热解毒、消积、止血、止痢的功效，用于菌痢、泄泻、小儿疳积、肝炎、衄血、吐血、尿血、便血、宫血等的治疗[l-2]。现代研究表明铁苋菜全草主要含黄酮、有机酸、生物碱等[3]，具有抗腹泻[4]、抗溃疡性结肠炎[5-6]、抗菌[7-8]、抗病毒[9]、止血[10]、止咳祛痰[11]、平喘[12]等作用。为了探究铁苋菜的抗炎镇痛活性，课题组早期曾对铁苋菜水煎剂进行了初步的抗炎活性探究，结果显示铁苋菜水煎剂腹腔注射对二甲苯致小鼠耳肿胀具有明显抑制作用[13]，铁苋菜水提物和醇提物灌胃给药对小鼠也具有明显抗炎镇痛作用，且水提物作用强于醇提物。为进一步探究铁苋菜抗炎镇痛的有效部位，以及有效部位如何发挥抗炎镇痛作用，本研究采用小鼠热板法、醋酸扭体法观察铁苋菜不同极性溶剂萃取部位的镇痛作用，以及小鼠耳肿法、大鼠足肿法及大鼠棉球肉芽肿法观察铁苋菜不同极性溶剂萃取部位抗炎作用，以筛选其抗炎镇痛作用的有效部位，并对醋酸所致疼痛模型小鼠血清PGE2、cAMP含量以及蛋清所致大鼠足跖致炎组织NO和PGE2含量进行测定，以初步探究其有效部位的抗炎镇痛作用机制，为铁苋菜的临床应用提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 动物

昆明种小鼠（18～22 g），清洁级，雌雄兼用；SD大鼠（180～220 g），清洁级，雌雄各半，均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号 SCXK(湘)2016-0003。

1.2 药物及试剂

铁苋菜2018年8月采于江西吉安，经井冈山大学医学部药学系周秋贵副教授鉴定为为大戟科铁觅菜属植物铁觅菜（L.）；盐酸吗啡注射液，东北制药集团公司沈阳第一制药厂，规格 10 mg/mL，批号130806-2；阿司匹林肠溶片，石家庄康力药业有限公司，规格25 mg，批号130525；戊巴比妥钠，上海西唐生物科技有限公司，批号 WS20110112；前列腺素E2（PGE2）ELISA试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司；一氧化氮（NO）检测试剂盒、环磷酸腺苷（cAMP）测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要仪器

RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHB-IIIA循环水式多用真空泵，上海豫康科教仪器设备有限公司；YLS-25A电动耳肿打耳器，济南益延科技发展有限公司；PV-200足肿容量测量仪，成都泰盟软件有限公司；RB-200智能热板仪，成都泰盟软件有限公司；H1850R高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；A590紫外/可见分光光度计，翱艺仪器(上海)有限公司；BIO-RAD680酶标仪，美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 铁苋菜不同萃取部位的制备

2.1.1 水提

取切成长1～2 cm 的干燥铁苋菜700 g，用适量纯净水浸泡0.5 h，第1次加纯净水12倍用文火煎煮1 h，第2、3次各加纯净水10倍分别煎煮0.5 h，合并3次煎出液，滤过，取滤液，浓缩至700 mL。取出300 mL水提液备用，剩下的400 mL水提液用于萃取。

2.1.2 萃取

将400 mL铁苋菜水提液装于1000 mL分液漏斗，每次以石油醚500 mL为溶剂进行萃取，反复多次，直至萃取液无色，合并所得萃取液，回收石油醚，得石油醚部位浸膏0.88 g。将经石油醚萃取过的溶液，再每次以乙酸乙酯500 mL为溶剂进行萃取，反复多次，直至萃取液无色为止，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯部位浸膏6.28 g。将乙酸乙酯萃取过的溶液再每次以正丁醇500 mL为溶剂进行萃取，反复多次，直至萃取液无色为止，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇，得正丁醇部位浸膏12.72 g。最后将正丁醇萃取后的溶液置于旋转蒸发仪旋转蒸发，得水部位浸膏97.78 g。

石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位用时用纯净水溶解配制。

2.2 铁苋菜不同萃取部位的镇痛作用

2.2.1 热板法

按参考文献[14-16]，筛选出合格雌性小鼠144只，按体质量随机分为12组：正常对照组（纯净水，10 mL/kg），盐酸吗啡溶液（20 mg/kg）阳性对照组，铁苋菜水提液（生药5 000、10 000 mg/kg）组，铁苋菜石油醚部位（11、22 mg/kg）组，铁苋菜乙酸乙酯部位（78.5、157 mg/kg）组，铁苋菜正丁醇部位（159、318 mg/kg）组，铁苋菜水部位（1222.25、2444.5 mg/kg）组，每组12只。铁苋菜水提液的给药剂量参考《中药大辞典》成人每日用量25～50 g[2]，按动物与人体的每千克体质量等效剂量折算系数（10倍）换算成小鼠的剂量，铁苋菜各萃取部位的给药剂量按萃取量相当于生药量的比例进行换算。将每只小鼠正常痛阈值各测2次，取其平均值为给药前正常痛阈值。给药除阳性对照组皮下注射（sc）盐酸吗啡溶液2 d外，其余各组小鼠均灌胃（ig）给药，给药容量均10 mL/kg，1次/d，连续给药5 d。分别于末次给药后30、60、90、120 min 测定小鼠痛阈值，若放入热板1 min仍无舔后足反应，就将小鼠捉出，其痛阈值计1 min。

2.2.2 醋酸扭体法和血清PGE2、cAMP含量的测定

按参考文献[14-16]，将144只雌雄各半的小鼠分为12组，每组12只，除了阳性对照组为阿司匹林（500 mg/kg）外，其余各组与“2.2.1”项同。各组小鼠均ig给药，给药容量均10 mL/kg，1次/d，连续给药5 d。于末次给药后1 h，各鼠均用0.6%醋酸0.2 mL/只ip（醋酸溶液临用前配制）。记录各组小鼠ip醋酸后15 min内扭体反应（腹部收缩内凹、躯干与后肢伸展、臀部抬起）的次数，并计算抑制率。

抑制率（%）＝（正常对照组扭体反应次数－给药组扭体反应次数）/正常对照组扭体反应次数×100%

ip醋酸30min后，将正常对照组、阿司匹林组和铁苋菜乙酸乙酯部位低、高剂量组小鼠断头取血，室温静置2h后，于4℃ 3 000 r/min离心10 min，分离血清，- 20℃保存备用。血清PGE2、cAMP含量测定均按试剂盒说明书进行操作。

2.3 铁苋菜不同萃取部位的抗炎作用

2.3.1 小鼠耳肿胀法

按参考文献[14-16]，小鼠分组及给药同“2.2.2”项。于末次给药1 h后，将100%二甲苯0.05 mL 均匀涂抹于每只小鼠左耳廓两面致炎，右耳作对照。0.5 h后拉断小鼠颈椎使其死亡，沿小鼠耳根部剪下双耳，用8 mm直径的电动耳肿打耳器在每只小鼠左右耳尖的相同部位打下圆耳片，用电子天平将圆耳片称重，计算耳肿胀度和肿胀抑制率。

耳肿胀度＝左耳片质量－右耳片质量

耳肿胀抑制率（%）＝（正常对照组耳肿胀度－给药组耳肿胀度）/ 正常对照组耳肿胀度×100%

2.3.2 大鼠足跖肿胀法和足跖致炎组织NO和PGE2的测定

按参考文献[14-16]，将120只雌雄各半SD大鼠，按性别和体质量随机分为12组，每组10只，具体分组方法及给药方法同“2.2.2”项。末次给药1 h后，每只大鼠左后足跖sc新鲜配制的10%蛋清生理盐水溶液0.1 mL致炎，用足肿容量测量仪分别测定各鼠致炎前及致炎后1、2、4、6 h的足跖容积，并计算足跖肿胀率。6 h后将正常对照组、阿司匹林组和铁苋菜乙酸乙酯部位低、高剂量组的大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉处死后，迅速摘取左后足肿胀足跖，纵向切开足跖组织，放入冷生理盐水中，于4 ℃浸泡过夜，离心取上清液。NO含量和PGE2含量测定均按试剂盒说明书进行操作。

足跖肿胀率（%）＝（致炎后足跖容积－致炎前足跖容积）/ 致炎前足跖容积×100%

2.3.3 大鼠棉球肉芽肿法

大鼠分组方法同“2.3.2”项。按参考文献[14-16]，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，在大鼠左右后肢腹股沟部位皮下各植入20 mg的棉球。从手术后第2日开始给药，给药剂量及途径与“2.2.2”项相同，连用药物7 d。第8天拉断大鼠颈椎使其死亡，把棉球连同其周围的结缔组织一起取出来，再把脂肪组织分离去掉，放干燥箱于60 ℃烘烤24 h，称其质量。将称得的量减去棉球原有质量即得肉芽肿质量，计算肉芽肿抑制率。

肉芽肿抑制率（%）＝（正常对照组肉芽肿质量－给药组肉芽肿质量）/ 正常对照组肉芽肿质量×100%

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 对热板法所致小鼠疼痛的影响

与正常对照组比较，给药前各组痛阈值差异无统计学意义（> 0.05）；铁苋菜乙酸乙酯部位和水提液低、高剂量组，给药后30、60、90、120 min明显延长热板所致小鼠的痛阈值（< 0.01），且具剂量依赖性；铁苋菜石油醚、正丁醇及水部位低、高剂量组给药后30、60、90、120 min差异无统计学意义（> 0.05）；吗啡溶液20 mg/kg给药后30、60、90、120 min显著延长热板所致小鼠的痛阈值（< 0.01）。与自身给药前比较，铁苋菜乙酸乙酯部位和水提液低、高剂量组，给药后30、60、90、120 min明显延长热板所致小鼠的痛阈值（< 0.01）；铁苋菜石油醚、正丁醇及水部位低、高剂量组给药后30、60、90、120 min差异无统计学意义（> 0.05）；吗啡溶液20 mg/kg组给药后30、60、90、120 min显著延长热板所致小鼠的痛阈值（< 0.01）。结果见表1。

表1 铁苋菜不同萃取部位对小鼠热板法痛阈值的影响（, n=12）

注：与正常对照组比较，**< 0.01；与自身药前痛阈比较，&&< 0.01。

3.2 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

表2结果表明，与正常对照组比较，铁苋菜乙酸乙酯部位和水提液低、高剂量组，均能明显减少醋酸所致小鼠扭体反应的次数（0.01），且具有剂量依赖性；铁苋菜石油醚、正丁醇及水部位低、高剂量组差异无统计学意义（> 0.05）；阿司匹林500 mg/kg给药后能显著减少醋酸所致小鼠扭体反应次数（< 0.01）。

表2 铁苋菜不同萃取部位对小鼠扭体反应的影响（,n=12）

注：与正常对照组比较，**< 0.01。

3.3 对醋酸致痛模型小鼠血清PGE2及cAMP含量的影响

与正常对照组比较，铁苋菜乙酸乙酯部位低、高剂量组明显降低醋酸所致小鼠血清PGE2和cAMP含量（< 0.01），且具剂量依赖性；阿司匹林500 mg/kg给药组也明显降低醋酸所致小鼠血清PGE2和cAMP含量（< 0.01）。与阿司匹林组比较，铁苋菜乙酸乙酯部位低、高剂量组给药后差异无统计学意义（> 0.05）。结果见表3。

表3 铁苋菜乙酸乙酯部位对醋酸致痛模型小鼠血清PGE2和cAMP含量的影响（, n=12）

注：与正常对照组比较，**<0.01。

3.4 对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

与正常对照组比较，铁苋菜乙酸乙酯部位和水提液低、高剂量组均明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀（< 0.01），且耳廓肿胀抑制率与剂量呈正相关；铁苋菜石油醚、正丁醇及水部位低、高剂量组差异无统计学意义（> 0.05）；阿司匹林500 mg/kg对二甲苯致小鼠耳廓肿胀具有显著抑制作用（< 0.01）。结果见表4。

表4 铁苋菜不同萃取部位对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（, n=12）

注：与正常对照组比较，**< 0.01。

3.5 对蛋清所致大鼠足跖肿胀的影响

与正常对照组比较，铁苋菜乙酸乙酯部位和水提液低、高剂量组对蛋清所致大鼠足跖肿胀有明显抑制作用（< 0.01），且具剂量依赖性；铁苋菜石油醚、正丁醇及水部位低、高剂量组差异无统计学意义（> 0.05）；阿司匹林500 mg/kg给药组也显著抑制蛋清所致大鼠足跖肿胀（< 0.01）。与阿司匹林组比较，铁苋菜水提液低剂量组给药后2、4、6 h及高剂量组给药后1、2、4、6 h，以及乙酸乙酯部位低、高剂量组给药后6 h差异无统计学意义（> 0.05）。结果见表5。

表5 铁苋菜不同萃取部位对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响（, n=10）

注：与正常对照组比较，**< 0.01；与阿司匹林组比较，#> 0.05。

3.6 对蛋清所致大鼠足跖致炎组织NO和PGE2含量的影响

与正常对照组比较，铁苋菜乙酸乙酯部位低、高剂量组明显减少蛋清所致大鼠足跖致炎组织NO和PGE2含量（< 0.01），且具剂量依赖性；阿司匹林500 mg/kg给药组也显著减少蛋清所致大鼠足跖致炎组织NO和PGE2含量（< 0.01）。与阿司匹林组比较，铁苋菜乙酸乙酯部位低、高剂量组给药后差异无统计学意义（> 0.05）。结果见表6。

表6 铁苋菜乙酸乙酯部位对大鼠足跖致炎组织NO和PGE2含量的影响（, n=10）

注：与正常对照组比较，**< 0.01；与阿司匹林组比较，#> 0.05。

3.7 对大鼠棉球肉芽肿的影响

与正常对照组比较，铁苋菜乙酸乙酯部位和水提液低、高剂量组对大鼠棉球肉芽肿均有显著抑制作用（< 0.01），且具有剂量依赖性；铁苋菜石油醚、正丁醇及水部位低、高剂量组差异不显著（> 0.05）；阿司匹林500 mg/kg给药后也明显抑制大鼠棉球肉芽肿（< 0.01）。与阿司匹林组比较，铁苋菜乙酸乙酯部位和水提液低、高剂量组差异不显著（> 0.05）。结果见表7。

表7 铁苋菜不同萃取部位对大鼠棉球肉芽肿的影响（, n=10）

注：与正常对照组比较，**< 0.01；与阿司匹林组比较，#> 0.05

4 讨论

本实验采用小鼠热板法、扭体法疼痛模型来考察铁苋菜不同极性溶剂萃取部位的镇痛作用，以筛选出镇痛作用的有效部位；采用小鼠耳肿胀法、大鼠足跖肿胀法及棉球肉芽肿法炎症模型来考察铁苋菜不同极性溶剂萃取部位的抗炎作用，以筛选出抗炎作用的有效部位；并对醋酸所致疼痛模型小鼠血清PGE2、cAMP含量以及蛋清所致的大鼠足跖致炎组织NO、PGE2含量进行了测定，以初步探究其抗炎镇痛作用机制。

本次小鼠热板实验是通过一定温度的热板（55 ℃）刺激小鼠足跖以产生缩足、舔足等疼痛反应。常以小鼠放入热板至开始舔后跖的时间为测痛的指标，即痛阈值，并以痛阈值大小来衡量药物抗痛效果的强弱[17]。热板刺激所引起的疼痛反应有中枢高位的参与[18]。小鼠醋酸扭体实验是通过醋酸注入小鼠腹腔，刺激腹膜产生炎症而引起腹痛，表现为腹部内凹、腹前壁紧贴桌面、臀部歪扭和后肢伸展等扭体反应，是用于筛选镇痛作用相对较弱的镇痛药的一种灵敏、操作简单方便、重现性又好的实验方法[18]。本实验乙酸乙酯部位ig给药对热板引痛法所引起的小鼠痛阈值延长明显，对醋酸刺激腹膜所引起疼痛的小鼠扭体反应次数减少显著，这表明乙酸乙酯部位均明显减轻物理因素温热刺激和化学因素醋酸刺激所引起的疼痛。

在抗炎实验中，采用化学刺激剂二甲苯涂擦小鼠耳廓两面引起小鼠耳廓肿胀及10%蛋清注射大鼠足跖引起大鼠足跖肿胀是以液体渗出为主的急性炎症表现，采用大鼠埋棉球肉芽肿是以增生为主的慢性炎症反应[17]。本实验乙酸乙酯部位ig给药对化学刺激剂二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀减轻明显，对蛋清引起的大鼠足跖肿胀和棉球引起的大鼠肉芽肿增生抑制显著，表明乙酸乙酯部位ig给药均显著抑制急、慢性炎症反应。

PGE2是重要的致痛物质，可直接刺激感觉神经末梢和提高痛觉感受器对其它致痛物质的敏感性而引起疼痛，还可触发疼痛信号转导[19]。有文献研究表明，cAMP也可引起感觉神经元过度兴奋和痛觉过敏[20]。本实验显示，乙酸乙酯部位可降低醋酸致痛模型小鼠血清PGE2、cAMP含量，提示乙酸乙酯部位的镇痛作用机制可能与减少疼痛介质PGE2和cAMP的合成有关。

NO和PGE2是重要的炎性介质，参与和介导炎性反应。NO参与血管舒张、血小板聚集等，尤其是在炎症反应中能够介导白介素-1、肿瘤坏死因子-α等炎症因子产生而加剧炎症反应[20]。PGE2除了是重要的致痛物质外，还是重要炎症介质，PGE2能扩张血管，使渗出增加，还能增敏血管对其他致炎物如缓激肽、组胺等反应，还会促使白细胞向炎症部位浸润等而介导炎症的发生发展[19]。本实验显示，乙酸乙酯部位ig给药后明显降低大鼠足跖致炎组织NO和PGE2含量，提示乙酸乙酯部位的抗炎机制可能与抑制炎症部位NO和PGE2的产生有关。

综上，铁苋菜乙酸乙酯部位对热板和醋酸所引起的疼痛均有明显镇痛作用，说明其镇痛有效部位主要为乙酸乙酯部位；在抗炎方面，乙酸乙酯部位对急、慢性炎症均具有良好的抑制作用，表明其抗炎作用部位也主要为乙酸乙酯部位；其镇痛作用机制可能与降低体内PGE2、cAMP的含量有关；其抗炎作用机制可能与抑制炎症部位NO和PGE2的产生有关。实验结果为其综合开发利用提供了一定的实验依据。但发挥主要抗炎镇痛作用的是哪种活性成分，对其他致痛和致炎介质是否有影响，有什么影响，这有待于后续更深入的研究。

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SCREENING OF THE ANTI-INFLAMMATORY AND ANALGESIC EFFECTIVE FRACTIONS OF

*LIANG Sheng-lin, LI Qing-yao, ZHOU Xi-gen

（Health Science Center, Jinggangshan University, Ji'an, Jiangxi 343009, China )

To screen the anti-inflammatory and analgesic effective fractions of, and to study the relative mechanisms.The analgesic effects of the effective fractions ofwere observed by hot plate and acetic acid writhing model. Meanwhile, the acute inflammatory models, such as xylene-induced ear swelling, egg white-induced paw swelling, and the chronic inflammatory model granuloma induced by cotton pellet implantation, were used in researching the anti-inflammatory effects of the effective fractions of.After the treatment with low- and high-dose ethyl acetate fraction, the pain threshold with hot plate method was significantly prolonged compared with the control groups and the data before the drugs administration (< 0.01). The writhing number was reduced after administration compared with the control groups (< 0.01). Moreover, low- and high-dose ethyl acetate fraction could significantly inhibit ear swelling in mice and paw swelling in rats (< 0.01). Also, ethyl acetate fraction decreased the granuloma of rats (< 0.01). The ethyl acetate fraction decreased significantly the serum PGE2,cAMP levels in mice with pain induced by acetic acid,and decreased significantly foot plantar inflammatory tissue NO, PGE2in rat with inflammation caused by egg white (< 0.01).The ethyl acetate fraction ofis the anti-inflammatory and analgesic effective fractions, and the mechanism of analgesic effect may be related to the reduction of the serum PGE2, cAMP levels, the mechanism of anti-inflammatory effect may be related to the reduction of NO and PGE2levels in the inflammatory tissue.

; analgesic; anti-inflammatory; effective fractions; mechanism

1674-8085（2022）03-0079-07

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2022.03.013

2021-04-06；

2021-10-08

全国中药资源普查项目(财社[2018]43号)；吉安市科技局指导性科技计划项目(吉市科计字[200]20号)

*梁生林(1962-)，男，江西吉安县人，教授，主要从事中草药药理及中药新药开发(E-mail：slliang1962@163.com).