红花椒提取物和青花椒提取物对慢性束缚应激小鼠的抗抑郁作用

谭邦银，于浩飞，谢建平，张素婷，王 晶，尹文耀，丁彩凤，张荣平，郭 英，张兰春

目前，临床多用西药治疗抑郁症，存在副作用大等问题，中药治疗副作用则相对较小，因而从中药中筛选抗抑郁的药用资源，逐渐受到关注[1]。花椒为芸香科植物青花椒Zanthoxylumschinifolium或花椒Zanthoxylumbungeanum的干燥成熟果皮，其含有生物碱等化合物[2]。花椒根部提取物可通过调节海马中的神经炎症和单胺类神经递质抑制脂多糖诱导的小鼠抑郁样行为[3]，而粗提物中化学成分种类较多，虽有抗抑郁作用，也不利于直接作为药物使用，更不利于从中分离高效的抗抑郁单体。本研究针对这一不足，鉴于临床疗效确切的抗抑郁药多为生物碱，故按富集生物碱的方法制备两受试物。根据预实验结果及文献[3]资料，以单次灌胃200 mg/kg受试物进行治疗，并进行行为学测试，监测血清与皮层中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、5-羟色胺(5-hydroxytryptophan, 5-HT)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)以及血清和脑中一氧化氮(nitric oxide, NO)的水平变化，初步评价两受试物的抗抑郁作用，旨为从两受试物中分离高效低毒的抗抑郁单体提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级雄性ICR小鼠45只， 4～5周龄，体质量(20±2)g，购自昆明医科大学实验动物学部，实验生产许可证号：SCXK(滇)K2020-0004，动物实验获得昆明医科大学动物实验伦理委员会的同意。

1.2 主要仪器与试剂多功能酶标仪、高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific)；高速组织匀浆仪(武汉塞维尔生物科技有限公司)；含种子的干青、红花椒果皮(市售)；盐酸舍曲林片(辉瑞制药有限公司，批号：H10980141)；橄榄油(益海嘉里食品营销有限公司)；Mouse BDNF ELISA检测试剂盒、Mouse 5-HT ELISA检测试剂盒、Mouse GSH ELISA检测试剂盒、Mouse NO ELISA检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 花椒提取物的制备分别取青花椒和红花椒粉末，加3倍量甲醇，(76±2) ℃提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶剂，得青花椒和红花椒浸膏。取青花椒浸膏，加水稀释，盐酸调pH为2～3，抽滤，滤液加氨水调pH为9～10，加3倍量乙酸乙酯，萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压回收溶剂，冷冻干燥，即得青花椒提取物；另取红花椒浸膏，加水稀释，D101大孔树脂吸附，依次用水、35%甲醇及甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，回收甲醇，加少量乙酸乙酯，除去脂溶性成分，减压挥干溶剂，冷冻干燥，即得红花椒提取物。

1.4 分组与造模将小鼠随机分成5组，每组9只，分别为正常组、模型组、盐酸舍曲林组(10 mg/kg)、红花椒提取物组(200 mg/kg)与青花椒提取物组(200 mg/kg)；记录小鼠体质量W0(g)，模型组及给药组用慢性束缚应激的方式复制抑郁模型，具体方法为：将小鼠放入50 ml四周开有通气孔的特制离心管中，用纱布与胶带封住离心管口，连续8 d，每天11 h。

1.5 给药与行为学测试整个实验过程只给予一次药物治疗，具体方法为：造模结束1 d后，记录小鼠体质量W1(g)。称取盐酸舍曲林，加橄榄油配成1 mg/ml的混悬液；取青花椒和红花椒提取物用橄榄油各配成20 mg/ml的混悬液，按0.1 ml/10 g灌胃给药，正常组和模型组则同法给予橄榄油。给药后第1天进行旷场实验：将小鼠放入长、宽均为50 cm，高为40 cm，底部为黑色的敞口木箱中央，记录6 min内小鼠进入中央区域次数(central area times，CAT)、中央时间百分比(percentage of central time，PCT)和中央路程百分比(percentage of central distance，PCD)。每只小鼠测试结束后，用75%乙醇溶液擦拭箱底，除去上一只小鼠留下的排泄物及气味，待酒精挥干后，再测试下一只小鼠。给药后第2天进行强迫游泳实验：将小鼠放入装有4.5 L水的5 L透明烧杯中，水温(25±2) ℃，待小鼠自由游泳适应2 min后，记录6 min内小鼠的不动时间百分比。每测完一只小鼠更换一次水。

1.6 ELISA法检测BDNF、5-HT、GSH及NO的含量给药后第3天，记录小鼠体质量W2(g)，用2%水合氯醛麻醉小鼠，心尖取血，全血4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上清液，即得待测液；取血后，处死小鼠并迅速取出小鼠大脑，液氮冷冻20 min后移至-80 ℃冰箱保存。指标测试前，取出小鼠大脑，冰上快速分离皮层，称重，9 g样品加2% PBS溶液1 ml，匀浆，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上清液，即得BDNF、GSH及5-HT待测液；取去除大脑皮层的半脑，称重，10 g样品加1 ml的NO提取液，匀浆，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上清液，即得NO待测液。按ELISA 试剂盒说明书测定上述待测液中BDNF、5-HT、GSH及NO的含量。

2 结果

2.1 花椒提取物对小鼠体质量的影响与正常组相比，各组小鼠W0无明显差异(FW0=0.80,P>0.05)，各组小鼠W1均降低，表明慢性束缚应激可致小鼠体质量降低(FW1=5.39,P<0.01)。与模型组相比，盐酸舍曲林组与红花椒提取物组小鼠W2均增加，提示红花椒提取物能逆转小鼠体质量的降低(FW2=4.09,P<0.05)，作用效果与盐酸舍曲林相当，见表1。

表1 花椒提取物对小鼠体质量的影响

2.2 花椒提取物对小鼠旷场行为的影响与正常组相比，模型组PCT、PCD及CAT均降低(P<0.05,P<0.01,P<0.01)，表明慢性束缚应激可致小鼠焦虑样行为；与模型组相比，红花椒提取物组PCD和CAT均增加(FPCD=5.03,FCAT=4.25;P<0.01,P<0.05)；盐酸舍曲林组和青花椒提取物组的PCT、PCD和CAT均增加(FPCT=3.60,FPCD=5.03,FCAT=4.25;P<0.01)；表明红花椒、青花椒提取物均可改善小鼠焦虑样行为，作用效果同盐酸舍曲林。见表2。

表2 花椒提取物对小鼠旷场行为的影响

2.3 花椒提取物对小鼠强迫游泳不动时间百分比的影响如图1所示，与正常组相比，模型组不动时间百分比增加(P<0.05)，表明慢性束缚应激可致小鼠抑郁样行为；与模型组相比，盐酸舍曲林组、红花椒提取物组及青花椒提取物组均能降低小鼠不动时间百分比(F=3.599;P<0.05,P<0.05,P<0.01)，提示红花椒提取物和青花椒提取物均能改善小鼠的抑郁样行为，作用效果与盐酸舍曲林相当。

图1 花椒提取物对小鼠强迫游泳不动时间百分比的影响(n=9)A：正常组；B：模型组；C：盐酸舍曲林组；D：红花椒提取物组；E：青花椒提取物组；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；与正常组比较：#P<0.05

2.4 花椒提取物对小鼠血清和皮层中BDNF的影响血清BDNF水平：与正常组相比，模型组、红花椒提取物组和青花椒提取物组均降低(P<0.01,P<0.01,P<0.05)；与模型组相比，红花椒提取物组和青花椒提取物组均无明显变化(F血清=5.467,P>0.05)，红花椒提取物组较盐酸舍曲林组有差异(P<0.05)，表明前者作用较后者弱，见图2a；皮层BDNF水平：与正常组相比，模型组降低(P<0.01)；与模型组相比，盐酸舍曲林组和红花椒提取物组均增加(F皮层=9.893,P<0.01)，提示红花椒提取物抗抑郁作用与改善小鼠大脑皮层中的BDNF水平有关，作用效果与盐酸舍曲林相当，见图2b。

图2 花椒提取物对小鼠血清中和皮层中BDNF的影响(n=5)A：花椒提取物对小鼠血清中BDNF水平的影响；b：花椒提取物对小鼠皮层中BDNF水平的影响；A：正常组；B：模型组；C：盐酸舍曲林组；D：红花椒提取物组；E：青花椒提取物组；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01；与盐酸舍曲林组比较：$P<0.05

2.5 花椒提取物对小鼠血清和皮层中5-HT的影响如图3所示，与正常组相比，模型组小鼠血清和皮层中5-HT水平均降低(P<0.05)；与模型组相比，红花椒提取物组小鼠血清和皮层中5-HT水平均增加(F血清=3.121,F皮层=2.105;P<0.05)，表明红花椒提取物抗抑郁作用与改善小鼠血清和皮层中的5-HT水平有关；青花椒提取物组小鼠皮层中5-HT的水平增加(F皮层=2.105,P<0.05)，血清中无明显变化，提示青花椒提取物抗抑郁作用与改善小鼠皮层中5-HT水平有关，两花椒提取物改善血清或皮层中5-HT水平的作用与盐酸舍曲林相当。

图3 花椒提取物对小鼠血清中和皮层中5-HT的影响(n=5)A：花椒提取物对小鼠血清中5-HT水平的影响；b：花椒提取物对小鼠皮层中5-HT水平的影响；A：正常组；B：模型组；C：盐酸舍曲林组；D：红花椒提取物组；E：青花椒提取物组；与模型组比较：*P<0.05；与正常组比较：#P<0.05

2.6 花椒提取物对小鼠血清和皮层中GSH的影响如图4所示，与正常组相比，模型组小鼠血清和皮层中GSH水平均降低(P<0.01,P<0.05)；与模型组相比，红花椒提取物组小鼠血清和皮层中GSH水平均改善(F血清=12.271,F皮层=2.664;P<0.01)，表明红花椒提取物抗抑郁作用与增加小鼠血清和皮层中GSH的水平密切相关；盐酸舍曲林组和青花椒提取物组小鼠血清中GSH的水平均增加(F血清=12.271,P<0.01)，皮层中GSH的水平均无明显变化，提示青花椒提取物的抗抑郁作用与改善血清中GSH水平有关。

图4 花椒提取物对小鼠血清中和皮层中GSH的影响(n=5)A：花椒提取物对小鼠血清中GSH水平的影响；b：花椒提取物对小鼠皮层中GSH水平的影响；A：正常组；B：模型组；C：盐酸舍曲林组；D：红花椒提取物组；E：青花椒提取物组；与模型组比较：**P<0.01；与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.7 花椒提取物对小鼠血清和脑中NO的影响

如图5所示，与正常组相比，模型组小鼠血清和脑中的NO的水平均增加(P<0.01)；与模型组相比，青花椒提取物组小鼠血清和脑中的NO的水平均降低(F血清=3.881,F脑=4.161,P<0.05)，表明青花椒提取物的抗抑郁作用与降低NO水平密切相关，且作用与盐酸舍曲林相当；红花椒提取物组小鼠血清和脑中的NO水平只呈现出降低的趋势。

图5 花椒提取物对小鼠血清中和脑中NO的影响(n=5)A：花椒提取物对小鼠血清中NO水平的影响；b：花椒提取物对小鼠脑中NO水平的影响；A：正常组；B：模型组；C：盐酸舍曲林组；D：红花椒提取物组；E：青花椒提取物组；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；与正常组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

抑郁症的发病率逐年增加，严重威胁人类生命健康[4]，盐酸舍曲林作为一线抗抑郁药物，具有较好的疗效，在临床被广泛应用，有研究[5-6]表明其治疗效果与文拉法辛相当，治疗总有效率达83.33%，但其也具有可累及神经系统、循环系统等全身多个重要系统器官，且为迟发型的不良反应。近年来，天然产物因其安全性高，从中筛选抗抑郁药物逐渐受到重视，五乙酰栀子苷、姜黄素等正广泛开展抗抑郁研究，结果表明两者均具有较好的抗抑郁作用，其中五乙酰栀子苷可通过调节下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal, HPA)轴，进而改善慢性轻度不可预见性应激所致大鼠抑郁行为[7-8]。花椒是一种药食同源的日常调味品，安全性高，有研究[3]表明其根部提取物具有较好的抗抑郁作用，具有深入研究的价值。

慢性束缚应激是使小鼠长时间束缚于密闭环境，最终感到逃脱无望而产生类似人类绝望、乏力等症状，广泛用于复制小鼠抑郁模型。旷场实验常用于评价焦虑状态，强迫游泳则广泛用于评价抑郁状态。本研究通过慢性束缚应激复制抑郁模型，经旷场及强迫游泳实验评价小鼠焦虑和抑郁状态，结果表明慢性束缚应激可致小鼠体质量降低，并产生典型的焦虑和抑郁样行为；较模型组，红花椒提取物可逆转慢性束缚应激所致小鼠的体质量降低，且给药组均能改善抑郁小鼠异常的行为学指标。

抑郁是一种复杂的精神疾病，具体发病机制尚不清楚，但增加5-HT水平，对改善抑郁症状有明确的疗效。BDNF具有调节和保护5-HT和多巴胺能神经元的作用，是两种神经元的重要调控物质[9]，上调抑郁模型大鼠海马区BDNF的表达可促进5-HT的水平增加。 NO含量显著增加，负反馈抑制四氢生物蝶呤的合成，进而影响5-HT的生物合成，降低NO水平，可改善5-HT水平；而且NO能使HPA轴亢进，进而导致抑郁；钩藤总生物碱能通过HPA轴降低肿瘤坏死因子及NO的水平，明显改善小鼠的抑郁行为[10]。因此改善抑郁小鼠的5-HT和BDNF，降低NO水平可明显改善抑郁症状。除此，增加大鼠血清和皮质部位GSH的水平，也可改善模型大鼠抑郁样行为[11]。本研究结果表明，按本研究方法制备的两受试物均能不同程度地改善上述因子水平，从而发挥一定的抗抑郁作用。

综上，按本研究方法制备的青花椒和红花椒提取物均表现出一定的抗抑郁作用，是筛选抗抑郁生物碱单体的理想原料。本研究的受试物为混合物，作用机制较复杂，清楚地阐明其抗抑郁机制比较困难，故只对其进行了抗抑郁的初步评价。对其抗抑郁的具体机制，还有待于后期进一步对两受试物中的主要化学成分的分离以及各成分的药理研究。