白术多糖对类风湿性关节炎大鼠的抗炎作用及TLR4/NF-κB信号通路的影响

李 梅，蒋锦梅，欧大明，黄丽芳，谢立虎,张 济

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜组织炎症为特征的自身免疫性慢性疾病，可导致多关节炎症、滑膜增生、关节破坏畸形等。临床表现为关节疼痛、酸胀、晨僵、活动受限，因其较高的致畸和致残率，给患者造成了极大的痛苦[1]。白术多糖(polysaccharide of atractylodes macrocephala koidz，PAMK)是天然中草药白术的主要有效成分之一，具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎等多重药理作用[2]。有研究[3]显示，Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)及其介导的核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路，通过诱发机体炎症反应、介导炎症因子表达，成为RA发病的关键。而PAMK可通过调控TLR4/NF-κB信号通路调节机体免疫功能[4]。推测PAMK可能会通过抑制TLR4/NF-κB信号通路改善RA，但PAMK在RA过程中具体作用如何，目前尚未见报道。因此，该研究拟建立RA大鼠模型，探讨PAMK对RA的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠60只，8周龄，体质量300～350 g，购自重庆医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK(渝)2018-0003。于室温22～24 ℃，相对湿度50%～70%环境下饲养，实验期间严格按照实验动物伦理学要求，自由饮水和摄食，实验前适应性喂养1周。

1.2 主要试剂及仪器PAMK购自陕西慈缘生物技术有限公司；雷公藤多苷片购自浙江得恩德医药有限公司；牛Ⅱ型胶原购自美国Chondrex公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司；TLR4、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor，MyD88)、p-NF-κB p65(Ser536)、NF-κB p65、Histone H3及β-actin抗体购自英国Abcam公司；Nuclear Extract Kit试剂盒购自美国Active Motif公司；HE染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；大鼠白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；全自动酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1动物模型制备与分组 参考文献[5]，采用Ⅱ型胶原诱导建立RA大鼠模型。具体操作如下：以醋酸为溶剂，将牛Ⅱ型胶原配制成浓度为2 mg/ml的溶液，与弗氏完全佐剂按1 ∶1混合配成乳剂Ⅰ，与弗氏不完全佐剂按1 ∶1混合配成乳剂Ⅱ。第1天于大鼠尾根部皮下注射乳剂Ⅰ，每只0.1 ml，第7天于大鼠尾根部皮下注射乳剂Ⅱ，每只0.1 ml。造模2周后，大鼠后肢足趾红肿，踝关节体积明显增大，提示造模成功。将造模成功大鼠随机分为模型组、阳性药物组和PAMK低、高剂量组，同时设置正常对照组，每组12只。分组后阳性药物组大鼠给予6.25 mg/kg[6]雷公藤多苷片灌胃，PAMK低、高剂量组大鼠分别按75、300 mg/kg剂量灌胃给予PAMK，正常对照组及模型组大鼠灌胃给予等量生理盐水，1次/d，连续4周。

1.3.2体质量检测 从第2次免疫(给药干预第0天)开始，每隔7 d测量1次各组大鼠体质量。

1.3.3足趾肿胀度检测 采用水容积法，从第2次免疫(给药干预第0天)开始，每隔7 d测量1次各组大鼠右后足容积。

1.3.4关节炎指数检测 参考文献[6]，从第2次免疫(给药干预第0天)开始，采取5级评分法，每隔7 d观察计算1次各组大鼠关节炎指数。大鼠所有关节炎指数之和即为每只大鼠关节炎指数值，最高计16分。

1.3.5胸腺和脾脏指数检测 取脾脏和胸腺组织，剔除脂肪，滤纸吸干表面液体并精密称量，分别计算其占体质量的比例(mg /g)。

1.3.6HE染色 取踝关节滑膜组织，于4%多聚甲醛中固定24 h，随后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、液体石蜡浸蜡、石蜡包埋等过程后，作连续5 μm切片，行常规HE染色，于光学显微镜下观察。

1.3.7ELISA检测 取踝关节滑膜组织匀浆及腹主动脉全血，于4 ℃下4 000 r/min离心10 min，分别提取上清液及血清，按照试剂盒操作说明，检测各组大鼠血清及踝关节滑膜组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.3.8Western blot检测 取踝关节滑膜组织，用RIPA裂解液提取总蛋白、Nuclear Extract Kit试剂盒提取核蛋白，通过BCA法进行蛋白质定量，取20 μg总蛋白或核蛋白与上样缓冲液均匀混合，随后SDS-PAGE电泳并进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入TLR4抗体(兔抗，1 ∶1 000)、MyD88抗体(兔抗，1 ∶1 000)、p-NF-κB p65抗体(兔抗，1 ∶1 000)、NF-κB p65抗体(兔抗，1 ∶1 000)、Histone H3抗体(兔抗，1 ∶1 000)、β-actin抗体(兔抗，1 ∶1 000)一抗，摇床孵育过夜；然后加入二抗(1 ∶10 000)，室温孵育2 h后ECL显色，以Histone H3、β-actin表达水平作为内参，应用Image J进行灰度分析，分析总蛋白TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及核蛋白NF-κB p65的相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量比较与正常对照组比较，模型组大鼠体质量降低(P<0.05)；与模型组比较，治疗1周后阳性药物组、PAMK高剂量组大鼠体质量升高(P<0.05)，而PAMK低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量比较

2.2 各组大鼠足趾肿胀度比较与正常对照组比较，模型组大鼠足趾肿胀度升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗1周后阳性药物组、PAMK高剂量组大鼠足趾肿胀度降低(P<0.05)，而PAMK低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠足趾肿胀度比较

2.3 各组大鼠关节炎指数比较与正常对照组比较，模型组大鼠关节炎指数升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗1周后阳性药物组、PAMK高剂量组大鼠关节炎指数降低(P<0.05)，而PAMK低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠关节炎指数比较分，n=12)

2.4 各组大鼠胸腺、脾脏指数比较与正常对照组比较，模型组大鼠胸腺、脾脏指数升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性药物组、PAMK高剂量组大鼠胸腺、脾脏指数降低(P<0.05)，而PAMK低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠胸腺、脾脏指数比较

2.5 各组大鼠踝关节滑膜组织病理学变化如图1所示，正常对照组大鼠滑膜组织结构正常，表面光滑无增生；模型组、PAMK低剂量组大鼠滑膜组织增生，层次不清，伴有大量炎性细胞浸润；阳性药物组、PAMK高剂量组滑膜组织增生和炎性细胞浸润明显改善。

图1 踝关节滑膜组织HE染色 ×400A:正常对照组；B：模型组；C：阳性药物组；D：PAMK低剂量组；E：PAMK高剂量组

2.6 各组大鼠血清及踝关节滑膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平与正常对照组比较，模型组大鼠血清及踝关节滑膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性药物组、PAMK高剂量组大鼠血清及踝关节滑膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)，而PAMK低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 各组血清及踝关节滑膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平

2.7 各组大鼠踝关节滑膜组织中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表达水平与正常对照组比较，模型组大鼠踝关节滑膜组织中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表达水平升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性药物组、PAMK高剂量组大鼠踝关节滑膜组织中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05)，而PAMK低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表6。

图2 Western blot检测各组心肌组织中TLR-4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表达A：正常对照组；B：模型组；C：阳性药物组；D：PAMK低剂量组；E：PAMK高剂量组

表6 各组踝关节滑膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白相对表达水平

3 讨论

自身免疫激活是RA发病的关键，随后的炎症因子大量释放，导致滑膜炎症发生。苍术属植物种类繁多，白术是其中之一，在中国药典中白术和苍术有着明确的区分，但在日本部分品种的苍术也被当做白术使用。有学者研究了包括白术在内的五种苍术属植物在RA中的作用，发现这些植物均可有效降低RA大鼠血清中炎症因子水平，从而改善RA[7]。但其研究仅限于白术复合物，并非单体物质，复合物的药理成分复杂，稳定性差，而PAMK作为白术中起主要作用的单体物质，成分单一，稳定性更好。因此，本研究进一步探索了PAMK对RA的抗炎作用及可能机制。

本研究通过Ⅱ型胶原诱导建立RA大鼠模型后，模型组大鼠精神倦怠，食欲减退，四肢出现明显红肿及变形，体质量较正常对照组大鼠显著降低，足趾肿胀度和关节炎指数显著升高，且踝关节滑膜组织增生，病理学改变明显，以上提示RA大鼠造模成功。经PAMK治疗后，大鼠体质量较模型组显著升高，足趾肿胀度和关节炎指数显著降低，且踝关节滑膜组织结构趋于正常，说明PAMK可保护RA大鼠踝关节滑膜组织，对RA有改善作用。

脾脏和胸腺是机体内重要的免疫器官，胸腺指数和脾脏指数可以在一定程度上反映机体免疫水平的高低及状态。本研究结果显示，模型组大鼠胸腺指数和脾脏指数较正常对照组显著升高，标志着RA大鼠免疫系统的激活，局部抗原发生改变，在滑膜组织中炎症因子大量释放，导致滑膜炎症的发生[8]。IL-1β是一种破骨细胞激活因子，它常与TNF-α同时合成和分泌，共同破坏关节软骨，造成关节损伤[9]。IL-6是一种重要的促炎因子，参与多种人体炎症反应和疾病，同时还能促进免疫细胞的增殖和分化[10]。IL-1β、IL-6和TNF-α刺激着软骨细胞、滑膜细胞分泌胶原酶等物质，破坏软骨细胞周围环境，是RA过程中起主要作用的炎性介质[11]。本研究显示，模型组大鼠血清及踝关节滑膜组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平较正常对照组显著升高，经PAMK治疗后，大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低，且胸腺指数和脾脏指数显著降低，说明PAMK可通过调节机体免疫水平，从而减轻RA大鼠炎症反应。

MyD88是TLR4/NF-κB信号通路中重要的接头蛋白分子，可以通过传导信号激活下游多种转录因子。TLR是非特异性免疫反应中的重要的蛋白质分子，能够通过识别脂多糖、膜脂蛋白等分子参与机体免疫系统调节[12]。其中TLR4是关键信号传导蛋白之一，可以通过与相应配体结合活化NF-κB，启动和调控炎症联级反应，在RA过程中发挥重要作用[13]。NF-κB由p65和p50两个亚基组成，通常情况下与其抑制性蛋白IκB结合而呈非活化状态，受到刺激后，NF-κB p65磷酸化使IκB降解，导致NF-κB入核并活化，从而刺激炎症因子的释放，加重炎症损伤[14]。本研究显示，模型组大鼠踝关节滑膜组织中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表达水平较正常对照组显著升高，标志着TLR4/NF-κB信号通路的激活，经PAMK治疗后，大鼠TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65蛋白表达水平显著降低，说明PAMK减轻RA大鼠机体炎症反应，可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路实现的。

综上所述，PAMK可以通过减轻机体炎症反应，起到对RA大鼠的治疗和保护作用，其机制可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化实现的，为RA的临床治疗提供了新的参考依据。