miR-3188对胃癌细胞恶性生物学行为的作用及机制研究

王坤男，张锦明，张 芸，张钧则，袁新普，邹贵军，张朝军

在全球范围内，胃癌是消化系统最常见恶性肿瘤之一[1]。在我国其发病率居第二位，是导致癌症相关死亡的重要因素[2]。随着医学水平不断发展已在一定程度上改善了胃癌患者预后，但晚期胃癌患者尚无有效治疗手段，中位生存期不到12个月[3-4]。因此，探索胃癌发生、发展的分子机制对胃癌防治至关重要。

microRNA是真核生物中抑制基因表达的内源性非编码RNA，可调节细胞增殖、凋亡、肿瘤生长等生物学功能[5]。有研究[6]证实大多数癌症中存在miRNA异常表达。相关研究[7-10]提示miR-3188在多种癌症的发生、发展过程中发挥重要作用。该研究通过生物信息学分析预测miR-3188的下游靶基因，通过使用基因干扰技术，观察miR-3188通过调控下游靶基因表达对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响，为探究胃癌进展机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料胃癌细胞系HGC-27细胞、胃黏膜细胞系GES-1细胞购自广州赛库生物技术有限公司，胃癌细胞系MGC-803细胞购自北纳创联生物科技有限公司，BGC-823细胞、MKN-45细胞获赠于陆军军医大学生物医学材料学教研室。DMEM培养基、PBS缓冲液购自索莱宝科技有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Gibco公司，LipofectamineTM2000转染试剂盒及TRIzol试剂均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；反转录试剂盒PrimeScript® RT reagent Kit、定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM、microRNA提取试剂盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and TB Green® qRT-PCR User Manual购自Takara公司；miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor、阴性对照以及pc-control、pc-NRAGE质粒均由苏州吉玛生物科技有限公司提供，含野生型和突变型NRAGE序列的荧光素酶报告基因质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供；细胞周期蛋白D 1(CyclinD 1)，基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP 9)，B-cell leuke-2蛋白(Bcl-2)，N钙黏蛋白(N-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)，E钙黏蛋白(E-cadherin)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗及电化学发光(ECL)液购自江苏亲科生物研究中心有限公司；NRAGE抗体购自Abcam公司，双荧光素酶检测报告试剂盒购自美国Progema公司；Transwell小室、Matrigel基质胶购自美国Corning公司；RIPA、BCA蛋白定量试剂盒等蛋白免疫印迹实验所需试剂均购自北京阳光英锐生物有限公司；CCK-8试剂盒购自北仁化学科技(北京)有限公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自Miltenyi Biotec公司。

1.2 细胞转染及分组细胞系HGC-27、MGC-803、BGC-823、MKN-45及GES-1放入含有10% FBS的DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2、相对湿度95%的恒温培养箱内培养。当细胞汇合度到80%左右时进行传代。将HGC-27细胞分为阴性对照组(miR-NC组、antimiR-NC组)：转染对照模拟物、对照抑制物；miR-3188上调组(miR-3188组)：转染miR-3188 mimic；miR-3188下调组(antimiR-3188组)：转染miR-3188 inhibitor；miR-3188+pc-control组：共同转染miR-3188 mimic与阴性对照质粒；miR-3188+pc-NRAGE组：共同转染miR-3188 mimic与NRAGE过表达质粒。将miRNA模拟物NC(miR-NC)、miRNA抑制物NC(antimiR-NC)、miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor、阴性对照质粒(pc-control)、NRAGE过表达质粒(pc-NRAGE)分别或共同转染至HGC-27细胞中，严格按照转染试剂盒说明书进行操作,首先将细胞均匀接种至6孔板中，待细胞汇合度至40%左右时，使用LipofectamineTM2000试剂进行细胞转染，转染48～72 h后进行后续实验。

1.3 qRT-PCR检测细胞中miR-3188及NRAGE mRNA表达水平采用TRIzol提取细胞总RNA后进行反转录。根据SYBR Premix Ex TaqTM、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and TB Green® qRT-PCR User Manual说明书进行qRT-PCR检测。miR-3188以U6为内参基因，NRAGE以GAPDH为内参基因，用公式2-ΔΔCt计算miR-3188和NRAGE mRNA表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 生物信息学分析使用基因预测网站Tar-getScan(www.targetscan.org)预测miR-3188的下游靶基因，从TCGA数据库(https://cancergenome.

nih.gov)下载胃癌患者的基因表达数据并分析miR-3188与所预测靶基因表达的相关性。

1.5 双荧光素酶报告实验利用生物信息分析数据库(TargetScan)预测NRAGE mRNA的3′UTR存在miR-3188的结合位点，分别构建重组荧光素酶报告基因质粒pGL3-NRAGE-3′UTR(WT-NRAGE)及突变荧光素酶报告基因质粒pGL3-NRAGE-3′UTR(MUT-NRAGE)，按照转染试剂说明将WT-NRAGE和MUT-NRAGE转染至细胞中，同时将miR-control或miR-3188 mimic转入各组细胞中，转染48 h后按照荧光素酶检测试剂盒说明书检测细胞荧光素酶活性。

1.6 Western blot检测转染后HGC-27细胞中NRAGE、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9及EMT相关蛋白表达收集各组对数生长期细胞，PBS洗涤细胞2次，加入RIPA裂解液，经12 000 r/min离心10 min后吸取上清液，测定蛋白浓度后各蛋白样品分别加入5倍上样缓冲液，金属浴变性5 min。取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳实验(80 V 20 min；120 V 90 min)，电泳结束后转移至PVDF膜，将PVDF膜剪裁为合适大小，室温下用5% 脱脂奶粉封闭2 h，加入各蛋白一抗(除GAPDH稀释比例为1 ∶5 000外，其余蛋白一抗稀释比例均为1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，5 min/次，加入二抗(稀释比例1 ∶8 000)于室温条件下孵育1 h，TBST洗涤3次，5 min/次，加入ECL化学发光试剂进行曝光拍照。

1.7 CCK-8法检测HGC-27细胞增殖率将各组细胞经胰蛋白酶消化后重新调整细胞浓度为5×105个/ml，以5 000个/孔的密度将细胞接种至96孔板内,每组设置6个复孔。分别在培养48、72 h后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，于细胞培养箱内孵育1 h，使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度(optical density，OD)值。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡情况各组细胞经PBS洗涤、胰蛋白酶消化后重悬调整细胞浓度为1×106个/ml，收集细胞后加入1 ml 1×binding Buffer洗涤两次后，加入5 μl Annexin V-FITC混匀、室温下避光孵育15 min，使用1 ml 1×Binding Buffer洗涤细胞，重悬细胞加入5 μl PI后使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.9 Transwell实验检测HGC-27细胞侵袭和迁移能力预备：将基质胶至于4 ℃冰箱内过夜解冻，次日使用无血清DMEM培养基将基质胶稀释至30 mg/ml，取100 μl稀释液置于Transwell小室上室；细胞处理：收集各组处于对数生长期的HGC-27细胞，胰蛋白酶消化后制备细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/ml，取100 μl细胞悬液置于铺满基质胶的Transwell小室的上室；恒温细胞培养箱内孵育24 h后用沾有PBS的棉签除去基质胶及Transwell小室的上室细胞，用多聚甲醛固定20 min，结晶紫溶液染色20 min，在显微镜下随机选取5个视野计数。细胞迁移实验：除去制备基质胶实验步骤外，其余实验步骤均与细胞侵袭实验相同。

1.10 统计学处理采用SPSS 21.0统计软件进行数据统计分析及制图。本研究统计数据均采用均值±标准差进行表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，双连续变量相关性分析采用Pearson检验。当P<0.05时，说明数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃黏膜细胞及胃癌细胞中miR-3188的表达水平qRT-PCR实验结果显示，miR-3188在 HGC-27、MGC-803、BGC-823、MKN-45 中的相对表达量低于 GES-1，其中 HGC-27 细胞中 miR-3188 相对表达量最低，选择 HGC-27 细胞进行后续实验，胃黏膜膜细胞同胃癌细胞系中的miR-3188相对表达量差异有统计学意义(F=362，P<0.001)，见图1。

图1 qRT-PCR检测正常胃黏膜细胞及胃癌细胞系中miR-3188表达与正常胃黏膜细胞GES-1比较：***P<0.001

2.2 miR-3188靶向调控胃癌细胞中NRAGE的表达生物信息分析数据库(TargetScan)预测NRAGE可能是miR-3188的靶基因，使用TCGA数据库进行数据挖掘，Spearman相关分析提示在胃癌中NRAGE的表达量与miR-3188表达量呈负相关(rho=-0.22，P<0.05)，见图2A。双荧光素酶报告实验显示，在WT-NRAGE转染的细胞中，与miR-control转染组细胞相比较，miR-3188 mimic 转染组的细胞荧光素酶活性降低，差异有统计学意义(F=1.791，P<0.01)，共转染MUT-NRAGE与miR-3188 mimic的细胞荧光素酶活性未见改变，差异无统计学意义(F=1.388，P>0.05)，见图2B。Western blot检测转染miR-3188 mimic、miR-3188 inhibitor及其阴性对照物miR-NC、antimiR-NC的HGC-27细胞中NRAGE蛋白的表达水平，结果显示转染miR-3188 mimic的HGC-27细胞中miR-3188组NRAGE蛋白表达水平低于miR-NC组，而转染miR-3188 inhibitor的HGC-27细胞中antimiR-3188组NRAGE蛋白表达水平高于antimiR-NC组。qRT-PCR检测结果显示，各组NRAGE mRNA表达水平差异无统计学意义(F=24.08，P>0.05)，见图3。

图2 miR-3188在HGC-27细胞中与NRAGE 3的靶向关系A：生物信息学分析预测miR-3188与NRAGE 3′UTR的结合位点及在胃癌组织中miR-3188与NRAGE表达水平的相关性；B：双荧光素酶报告实验验证miR-3188的靶基因；与WT-NRAGE+miR-control比较：**P<0.01

图3 miR-3188对HGC-27细胞NRAGE蛋白及mRNA表达水平的影响A：miR-NC组；B：miR-3188组；C：antimiR-NC组；D:antimiR-3188组

2.3 miR-3188通过调控NRAGE表达抑制HGC-27细胞增殖CCK-8实验结果显示，转染48 h时，同miR-NC组相比，miR-3188组细胞增殖率降低，差异有统计学意义(F=14.504，P<0.001)，而miR-3188 mimic+pc-NRAGE组的细胞增殖率高于miR-3188 mimic+pc-control组，差异有统计学意义(F=2.630，P<0.001)；转染72 h时，同miR-NC组相比，miR-3188 mimic组细胞增殖率降低，差异有统计学意义(F=8.301，P<0.001)，而miR-3188 mimic+pc-NRAGE组的细胞增殖率高于miR-3188 mimic+pc-control组，差异有统计学意义(F=2.125，P<0.001)，见图4。

图4 miR-3188靶向NRAGE对HGC-27细胞增殖的影响与miR-NC组比较：***P<0.001；与miR-3188+pc-control组比较：###P<0.001；A:miR-NC组；B:miR-3188组；C:miR-3188+pc-control组；D:miR-3188+pc-NRAGE组

2.4 miR-3188通过调控NRAGE表达促进HGC-27细胞凋亡流式细胞术实验结果提示，同miR-NC组相比，miR-3188组的细胞凋亡率增加，差异有统计学意义(F=16.735，P<0.001)，而miR-3188+pc-NRAGE组细胞凋亡率低于miR-3188+pc-control组，差异有统计学意义(F=1.96，P<0.01)，见图5。

图5 miR-3188靶向NRAGE对HGC-27细胞凋亡的影响A：流式细胞术检测各组细胞凋亡率变化；B：与miR-NC组比较：***P<0.001；与miR-3188+pc-control组比较：##P<0.01；a：miR-NC组；b：miR-3188组；c：miR-3188+pc-control组；d：miR-3188+pc-NRAGE组

2.5 miR-3188通过调控NRAGE表达抑制HGC-27细胞侵袭及迁移能力Transwell实验结果提示，同miR-NC组相比，miR-3188组各视野下的细胞侵袭数下降，差异有统计学意义(F=5.760，P<0.01)，各视野下的细胞迁移数下降，差异有统计学意义(F=4.590，P<0.01)；同miR-3188+pc-control相比，miR-3188+pc-NRAGE组各视野下细胞侵袭数升高，差异有统计学意义(F=2.151，P<0.01)，各视野下细胞迁移数升高，差异有统计学意义(F=3.361，P<0.01)，见图6。

图6 miR-3188靶向NRAGE对HGC-27细胞侵袭、迁移能力的影响 ×200与miR-NC组比较：**P<0.01；与miR-3188+pc-control组比较：##P<0.01

2.6 miR-3188通过调控NRAGE表达抑制HGC-27细胞的增殖、凋亡、转移、EMT相关蛋白的表达Western blot结果显示，miR-3188组的N-cadherin、Vimentin、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9蛋白表达水平低于miR-NC组，而miR-3188+pc-NRAGE组N-cadherin、Vimentin、CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9的表达水平高于miR-3188+pc-control组，同时miR-3188组E-cadherin蛋白表达水平高于miR-NC组，而miR-3188+pc-NRAGE组E-cadherin蛋白表达水平低于miR-3188 mimic+pc-control组，见图7。

图7 miR-3188靶向调控NRAGE对HGC-27细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、EMT相关蛋白表达影响A：miR-NC组；B：miR-3188组；C：miR-3188+pc-control组；D：miR-3188+pc-NRAGE组

3 讨论

胃癌是当前威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一，探索胃癌的发病机制及寻找潜在治疗靶点仍是需要解决的重要难题。大量研究已经证实miRNA在众多癌症当中存在异常表达，其在癌症的诊断及治疗方面的价值不言而喻，同时越来越多的研究亦表明miRNA密切参与调控胃癌的发展过程。例如，miR-505可通过靶向调控HMGB 1抑制胃癌细胞增殖并促进胃癌细胞凋亡[11]。相反，miR-532可靶向调控NKD 1促进胃癌细胞的迁移和侵袭[12]。miRNA在胃癌发展过程中可扮演多种角色并发挥重要作用，因此研究miRNA对胃癌细胞的生物学行为的影响对探索胃癌发病机制及发展过程具有重要意义。

有研究[7]证实miR-3188在不同癌症当中发挥重要作用，例如在鼻咽癌中，miR-3188可作为肿瘤抑制因子直接靶向mTOR参与FOXO 1介导的细胞生长抑制，肿瘤发生和鼻咽癌化疗耐药。miR-3188在头颈部癌(HNC)细胞系、组织来源的外泌体及其亲本癌症相关成纤维细胞(CAFs)中低表达，外泌体内的miR-3188可通过靶向Bcl-2影响HNC细胞的增殖和凋亡[8]。miR-3188在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中通过mTOR/PI3K/AKT/c-jun信号通路与FOXO 1相互作用从而抑制NSCLC细胞增殖[9]。相反，miR-3188在乳腺癌组织和细胞中表达上调，并可通过抑制p 27促进乳腺癌细胞增殖[10]。本研究结果显示miR-3188在胃癌细胞中的表达量低于正常胃黏膜细胞，通过在胃癌细胞HGC-27中转染miR-3188 mimic，并进行CCK-8实验、流式细胞术、Transwell实验，实验结果显示在胃癌细胞HGC-27中过表达miR-3188能够抑制胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其发生凋亡，miR-3188可能在胃癌发展过程中发挥抑癌作用。

本研究通过生物信息学分析预测NRAGE可能是miR-3188的靶基因，有研究[13]表明，在胃癌组织中NRAGE表达上调与TNM分期、局部浸润和预后不良相关。此外，荧光素酶报告实验结果显示，在WT-NRAGE转染的细胞中，miR-3188过表达降低荧光素酶活性，而在MUT-NRAGE转染的细胞中，则未见荧光素酶活性降低，该结果显示NRAGE是miR-3188的靶基因。通过在胃癌细胞HGC-27中分别转染miR-3188 mimic及miR-3188 inhibitor，Western blot及qRT-PCR结果显示miR-3188可负向调控NRAGE蛋白表达，但不影响其mRNA表达水平。为进一步探究胃癌细胞中miR-3188是否通过调控NRAGE发挥抑癌作用，将pc-control及pc-NRAGE分别转染至miR-3188过表达的HGC-27细胞中，CCK-8实验、流式细胞术、Transwell结果显示转染pc-NRAGE可逆转miR-3188对胃癌细胞HGC-27增殖、侵袭及迁移能力的抑制作用，并减少细胞凋亡。CyclinD 1、Bcl-2、MMP 9分别是细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移生物学行为的重要标志蛋白[14-15]。Western blot结果提示miR-3188/NRAGE轴可能通过干扰上述蛋白表达而抑制胃癌细胞发展。EMT机制在肿瘤的侵袭、转移过程中发挥重要作用，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等蛋白是EMT的标志蛋白[15]。本研究结果显示胃癌细胞HGC-27中miR-3188过表达可通过抑制NRAGE表达导致N-cadherin、Vimentin蛋白表达下调同时促进E-cadherin蛋白表达。这一结果提示在胃癌细胞HGC-27中，miR-3188可能通过靶向调控NRAGE抑制EMT进程。

综上所述，miR-3188过表达可抑制胃癌细胞的生长，其作用机制可能与通过靶向调控NRAGE的表达有关，该研究结果为探索胃癌发展机制及找寻新的胃癌治疗靶点提供了实验依据。