土壤微生物在枸溶性和聚合态磷肥活化利用中的作用

杨紫杭，张 林，冯 固

（中国农业大学资源与环境学院/植物-土壤相互作用教育部重点实验室/国家农业绿色发展研究院，北京 100193）

磷在自然和农业生态系统中起着不可替代的作用[1-4]。在农业生产中，往往通过施用磷肥提高土壤有效磷含量[5-7]。近年来，农田施用的磷肥品种逐渐趋向单一化[8]，实际生产中很少考虑到土壤-磷肥的匹配，即根据土壤性质来选用合适的肥料品种。土壤和磷肥的不匹配将导致磷肥进入土壤后被快速固定[9]，导致肥料利用率低且引发环境风险[6,10-14]。土壤与肥料pH匹配非常重要，李青军[15]研究发现，在新疆碱性土壤上，磷酸二铵 (碱性肥料) 的肥效要显著低于磷酸一铵和重过磷酸钙 (酸性肥料) 的肥效。关于土壤-磷肥匹配提高磷肥利用率的研究主要集中在物理、化学措施上。如通过改变肥料形态降低土壤对磷肥的吸附作用，褚贵新等[14]通过对固体磷肥和液体磷肥的研究发现，在石灰性土壤上，与固体磷肥相比，通过滴灌追施液体磷肥可减少土壤对磷的固定，提高土壤磷的有效性；通过添加化学物质增加对磷肥的溶解作用[16]；庞荣丽等[16]研究发现，小分子有机酸能够活化土壤难溶性磷，草酸、柠檬酸和酒石酸均促进了土壤磷向有效形态转化。而对于土壤微生物提高磷肥利用率的研究却鲜见报道。近年来研究发现，微生物在帮助植物根系利用、获取磷的过程中发挥着重要的作用[17]。土壤微生物包括细菌、真菌、古菌和微动物等，它们栖息在土壤和所有生物的表面，具有生物降解、固氮、提高土壤肥力、溶磷剂和植物生长促进剂的潜力[18-20]。在土壤-磷肥匹配的过程中，土壤微生物对不同形态磷肥利用效率的提高有何影响尚不清楚。

农田常见的磷肥形态主要包括：水溶性磷肥 (磷酸一铵，MAP)、枸溶性磷肥 (钙镁磷肥，CMP)、聚合态磷肥 (聚磷酸铵，APP)等[21-24]。不同形态磷肥的利用机制存在差异，水溶性磷肥提供的速效磷养分可直接被作物吸收利用，枸溶性磷肥和聚合态磷肥的活化主要包括有机酸活化和磷酸酶活化。MAP是一种含有氮和磷两种营养元素的酸性肥料[25]，其中的磷为水溶性磷，肥料利用效率高且释放快，易于被植物吸收利用，存在前期肥效过高后期失效的问题。MAP主要为磷酸盐组分，在石灰性土壤上具有较高的有效性且可直接被植物吸收利用。CMP是以低品位磷矿为原料生产的枸溶性磷肥，需要依靠酸性物质通过化学溶解将其活化，本身为碱性肥料在石灰性土壤中的有效性较低[26]。APP中的聚合态磷组分需要通过磷酸酶水解成正磷酸盐后才能被作物吸收利用[27]，在土壤中APP水解是化学和生物介导的反应[23]，水解受到磷酸酶活性、pH、温度和金属离子的影响[28-32]。

土壤微生物通过溶解、矿化作用从土壤难溶性磷和有机磷中释放磷[33]。在碱性土壤上分泌酸性物质以提高磷溶解度[34-36]，de Oliveira Mendes等[37]研究发现，微生物分泌的有机酸中，草酸、柠檬酸和苹果酸能够高效溶解难溶性磷灰石。Strafella等[38]研究表明，从小麦根际分离的乳酸菌能够产生有机酸促进培养基 (NBRIP培养基) 中磷酸三钙的溶解。Castagno等[39]研究发现，细叶百脉根 (Lotus tennis) 受低磷胁迫时，从土壤中分离的解磷微生物能够分泌葡萄糖酸溶解磷酸盐促进作物生长；其与植物互作分泌磷酸酶以提高植物吸收磷效率[40-41]，Zhang等[42]研究发现，植物能够为微生物提供碳源，作为回报，微生物会释放磷酸酶矿化有机磷供作物吸收。Jorquera等[43]研究发现，具有矿化植酸钠和溶解磷酸钙能力的细菌能够产生磷酸水解酶增加磷释放。综上所述，土壤微生物对枸溶性磷肥和聚合态磷肥的活化至关重要，但土壤微生物在其中发挥了多大的作用目前尚不清楚。

在有关外源性物质的降解/吸附/迁移的研究中，土壤灭菌经常用于消除或降低微生物活性[44-45]。采用高温灭菌杀死土壤中的微生物[46]，是研究土壤微生物对植物生长和磷活化吸收影响的常用方法[47]。与灭菌处理比较探究土壤微生物作用时，存在两种研究方法分别是土壤灭菌后接种土壤细菌悬液和土壤不灭菌处理。土壤灭菌后接种土壤悬液的方法主要用于研究土壤微生物多样性，不同稀释倍数可以降低土壤微生物多样性[48]。而不灭菌处理与灭菌处理做比较，能够保障试验土壤微生物群落的多样性，更贴近于实际生产。本研究采用玉米盆栽试验的方法，施用MAP、CMP、APP三种形态磷肥，通过土壤灭菌和不灭菌处理，探究在土壤-磷肥匹配过程中，土壤微生物对上述磷肥利用效率的影响。本研究将为通过调控微生物活性减少化肥施用提供理论基础，有助于针对性的开展微生物技术的研究来促进农业绿色发展。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试植物为玉米 (Zea maysL.)，品种为‘郑单958’。挑选大小、重量相似的玉米种子在10% H2O2中浸泡15 min 进行表面消毒，用蒸馏水洗涤10次，确保H2O2被洗净，后转移到湿润的滤纸上面均匀铺开，并覆盖上一层滤纸保湿，在28℃的黑暗条件下萌发48 h，期间保持滤纸湿润。选择出芽一致的种子用于播种。

供试土壤为褐土 (简育干润淋溶土)[49]，采自河南省洛阳市偃师高龙镇原偃师农场 (112°42′ E, 34°3′N)，采样深度0—20 cm，土壤理化性质为pH(土∶水=1∶2.5) 8.05、有机质13.15 g/kg、碱解氮71.26 mg/kg、速效磷 (Olsen-Pi) 4.53 mg/kg、速效钾224 mg/kg。将采集的土壤剔除杂物及残留根系后风干、过2 mm筛。

供试肥料为磷酸一铵 (云南云天化股份有限公司) P2O550%、钙镁磷肥 (烟台市烟农富邦肥料科技有限公司) P2O511%和聚磷酸铵 (云南天耀化工有限公司) P2O558%。

1.2 试验设计

本试验为双因素完全随机区组设计。供试磷肥品种包括：磷酸一铵 (MAP)、钙镁磷肥 (CMP)、聚磷酸铵(APP)，肥料用量为等量P 100 mg/kg；以不施磷肥处理为对照 (CK) 。土壤处理包括：灭菌、不灭菌，灭菌采用105℃高温灭菌2 h。所有处理加入N 200 mg/kg (尿素)、K 200 mg/kg (硫酸钾)、Mg 50 mg/kg (七水硫酸镁)、Zn 5 mg/kg (七水硫酸锌)、Mn 5 mg/kg (硫酸锰)、Cu 2 mg/kg (五水硫酸铜) 作为基础养分，满足玉米的正常生长。每盆装土2 kg，每个处理4次重复。

1.3 播种、日常管理及收获

盆栽试验于2019年9月17日至10月20日在中国农业大学资源与环境学院温室中 (116°16′E,40°1′N) 进行。将混好肥料和营养液的土壤分装成1.7和0.3 kg，将1.7 kg土壤装盆 (盆内套保鲜袋)，表面摊平，浇360 mL去离子水 (土壤含水量18%)，待水分完全渗透后，使用酒精灭菌的镊子将催芽的玉米种子小心放入，每盆3颗，然后将0.3 kg土均匀盖在种子上面。播种完成后用保鲜袋封住盆口，待出苗后将保鲜袋打开。室内温度保持在25℃～35℃。根据实际情况每日早晚各浇50 mL去离子水，每周称重以保证土壤含水量在18%左右。2019年10月20日收获，土壤取样时切除表层2 cm土壤，然后分别收获地上部、根际土、非根际土。根际土壤采用抖根法去除与根系结合不紧密的土壤，用毛刷扫根收集得到根际土壤，其余土壤充分混匀、过筛得到非根际土壤。土壤样品一部分放在-20℃冰箱用于测定土壤碱性磷酸酶活性；一部分在室温下自然风干，测定土壤速效磷和土壤pH。植株样品放于信封内带回实验室立即处理。

表1 不同供试肥料pHTable 1 The pH of tested fertilizers

1.4 测定指标及测定方法

生物量和植株磷浓度测定：将植株地上部剪下放于信封内，105℃杀青30 min，65℃烘干至恒重，称量干重；将烘干的玉米植株磨碎过0.3 mm筛，称取0.20 g置于消煮管中，经H2SO4-H2O2联合消煮后，采用钼锑抗比色法测定植株磷吸收量[50]。

pH用土水比1∶2.5 (w∶v)，pH计 (Mettler Toledo-Seven Compact S210) 测定；土壤速效磷用浓度为0.5 mol/L的碳酸氢钠 (pH=8.5) 浸提—钼蓝比色法测定[50]；土壤碱性磷酸酶活性测定方法，称取0.5 g土壤加入50 mL离心管中，向离心管中加8 mL碳酸氢钠缓冲溶液、2 mL对硝基苯磷酸二钠 (p-NPP)溶液，混匀后放入30℃水浴锅中培养30 min，后加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液终止反应，12000 r/min离心10 min，吸取上清液200 μL于96孔板中，酶标仪405 nm波长下比色测定；对照样品先加入NaOH溶液终止反应，其余操作相同[51]。

1.5 数据分析

采用施磷处理与不施磷对照的差值反映磷肥效应 (指标包括生物量、植株磷吸收量、土壤速效磷含量、土壤碱性磷酸酶活性)。用不灭菌与灭菌处理的差异反映土壤微生物的作用强度 (土壤微生物效应)。采用SPSS 26.0 (IBM) 和R语言 (R 3.6.3) 进行数据统计分析。采用单因素方差分析(ANOVA)，分别分析土壤微生物及不同磷肥对植物生物量、植株磷吸收量、土壤速效磷、肥料利用率、pH、碱性磷酸酶活性的影响，多重比较采用Duncan新复极差法检验 (P＜0.05)。采用双因素方差分析法，分析土壤微生物和不同磷肥及其交互作用对植物生物量、植株磷吸收量、土壤速效磷、肥料利用率、pH、碱性磷酸酶活性的影响。采用R语言中的“factoextra”包进行主成分分析(PCA)。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物及不同磷肥品种对玉米生物量的影响

土壤微生物显著提高了APP处理的玉米生物量，提高幅度0.65 g/pot，即提高了34.2% (表2)。而土壤微生物对MAP、CMP处理的生物量无显著影响。此外，生物量在不同磷肥品种下存在显著差异(表2)。灭菌条件下，3种磷肥肥效均存在显著差异，表现为MAP＞APP＞CMP。不灭菌条件下，MAP和APP处理间的玉米生物量无显著差异，但二者显著高于CMP处理。

表2 施用不同磷肥品种时土壤微生物对玉米生物量的效应Table 2 Effects of soil microorganisms on maize biomass under different types of phosphorus fertilizer

2.2 土壤微生物及不同磷肥对玉米磷吸收量的影响

土壤微生物显著提高了APP处理玉米磷吸收量(表3)。灭菌处理下，MAP、CMP和APP的磷吸收量分别为10.42、0.49、5.49 mg/pot；不灭菌处理下，磷吸收量分别为9.00、1.07、7.75 mg/pot，土壤微生物对不同磷肥品种处理磷吸收量的贡献分别为-1.42、0.57、2.26 mg/pot ，CMP、APP 处理的增加量分别为116.3%和41.2%。不同磷肥品种对磷吸收量的影响存在显著差异 (P＜0.001)。在灭菌条件下，MAP、CMP和APP的肥效间具有显著差异，表现为MAP＞APP＞CMP。MAP和APP的肥效在不灭菌条件下无显著差异，但二者显著高于CMP处理。

表3 施用不同磷肥品种时土壤微生物对玉米磷吸收量的效应Table 3 Effects of soil microorganisms on maize P uptake under different phosphorus fertilizer types

2.3 土壤微生物及不同磷肥对磷肥利用率的影响

土壤微生物显著提高了APP处理的磷肥利用率，增加了1.12个百分点，即提高了40.7% (图1)。而土壤微生物对MAP、CMP处理的磷肥利用率无显著影响。此外，磷肥利用率在不同磷肥品种下存在显著差异 (图1)。灭菌条件下，3种磷肥品种处理的磷肥利用率均存在显著差异，表现为MAP＞APP＞CMP。不灭菌条件下，MAP和APP处理间的磷肥利用率无显著差异，但二者显著高于CMP处理。

图1 磷肥利用效率Fig. 1 Phosphorus fertilizer use efficiency

2.4 土壤微生物及不同磷肥对土壤速效磷含量和pH的影响

土壤微生物和磷肥品种对玉米土壤速效磷含量具有显著影响 (表4)。土壤微生物显著影响了MAP、APP处理的根际土壤速效磷含量。灭菌处理下，MAP、CMP、APP处理的根际土壤速效磷含量分别为44.44、1.82、26.11 mg/kg，其中MAP、CMP、APP处理之间均存在显著差异，表现为MAP＞APP＞CMP。不灭菌处理下，MAP、CMP、APP处理的根际土壤速效磷含量分别为33.34、4.15、36.09 mg/kg，其中MAP、APP处理之间无显著差异，但二者显著高于CMP处理。不灭菌土壤CMP、APP处理的根际土壤速效磷含量较灭菌土壤分别增加了128.0%和38.2%。

表4 施用不同磷肥品种时土壤微生物对根际、非根际土壤速效磷的效应Table 4 Effects of soil microorganisms on Olsen-Pi content in rhizosphere and bulk soil under different phosphorus fertilizer types

玉米非根际土壤速效磷含量在不同磷肥品种下的变化趋势与根际相似 (表4)，土壤微生物显著降低了MAP处理的非根际土壤速效磷含量。灭菌条件下MAP、CMP、APP处理非根际土壤速效磷含量分别为52.44、0.91、34.21 mg/kg，其中MAP、CMP、APP处理之间存在显著差异，表现为MAP＞APP＞CMP。不灭菌处理下不同磷肥品种间的非根际土壤速效磷含量分别为34.20、5.41、36.84 mg/kg，MAP、APP处理间无显著差异，CMP处理的速效磷含量较低且显著低于MAP和APP处理。

土壤微生物和磷肥品种对根际土壤ΔpH有显著影响(图2a)。土壤微生物显著降低了CMP、APP处理的根际土壤ΔpH，对MAP处理的根际土壤ΔpH无显著作用。灭菌条件下，MAP、CMP、APP处理的ΔpH分别为-0.31、0.24、-0.29，其中CMP与MAP和APP处理之间均存在显著差异，表现为CMP＞APP＞MAP。不灭菌条件下，MAP、CMP、APP处理的ΔpH分别为0.05、-0.56、-0.68，MAP与CMP和APP处理之间均存在显著差异，表现为MAP＞CMP＞APP。磷肥品种对非根际土壤ΔpH具有显著影响 (图2b)，在灭菌和不灭菌条件下，CMP处理土壤ΔpH均显著高于MAP、APP处理。

图2 根际和非根际土壤pH的变化Fig. 2 Changes in pH of rhizosphere and bulk soil

2.5 土壤微生物及不同磷肥对土壤碱性磷酸酶活性的影响

图3显示，灭菌处理显著降低了MAP和APP处理下玉米根际土壤的碱性磷酸酶活性的变化值。土壤微生物显著提高了MAP、APP处理的碱性磷酸酶活性的变化值，降低了CMP处理的碱性磷酸酶活性的变化值。灭菌处理下，与不施磷处理相比，MAP、CMP、APP处理下根际土壤碱性磷酸酶活性分别增加 0.04、2.67、3.92p-NPP μg/(g·min)，增加幅度表现为APP≈CMP＞MAP，但二者均显著高于MAP处理。不灭菌处理下，与不施磷处理相比，MAP、CMP、APP处理根际碱性磷酸酶活性分别增加了 3.21、-0.01、5.41p-NPP μg/(g·min)，APP 与CMP间存在显著差异。灭菌处理下，不施磷处理相比，MAP、CMP、APP处理非根际土壤碱性磷酸酶活性分别增加 0.41、-3.91、-2.25p-NPP μg/(g·min)，CMP处理显著低于MAP处理；不灭菌处理分别增加 1.21、-1.13、1.37p-NPP μg/(g·min)，不同磷肥品种间均无显著差异。

图3 根际和非根际碱性磷酸酶活性的变化Fig. 3 Changes of ALP activity in rhizosphere and bulk soil

2.6 土壤微生物和不同磷肥对玉米生长状况、土壤生物化学性质的影响

主成分分析 (PCA) (图4)表明，施用MAP、APP与CMP的玉米生长和土壤生物化学性质不同。施用MAP和APP处理样品均与CMP处理表现出不同的聚类。结果表明，MAP、APP处理的玉米生长状况和土壤生物化学性质受到土壤微生物的影响，不灭菌组的MAP、APP数据点与灭菌组聚类均不同，CMP处理聚类未分开。前两个坐标轴总共解释了土壤生物化学性质变异的81%，其中第一和第二轴分别解释了67.98%和13.11%。MAP、APP处理在灭菌与不灭菌条件下均表现出不同的聚类。

图4 玉米生长状况和土壤生化指标主成分分析Fig. 4 Principal component analysis of maize growth and soil biochemical indicators

3 讨论

本研究结果表明，土壤微生物对水溶性磷肥、枸溶性磷肥和聚合态磷肥的作用效应不同，土壤微生物显著提高了聚合态磷肥的利用率，对水溶性磷肥、枸溶性磷肥的利用率无显著影响。土壤微生物影响了水溶性磷肥和聚合态磷肥处理的玉米生长和土壤生物化学性质 (图4)。

MAP是高浓度水溶性速效磷肥，MAP中的磷酸盐组分可以被作物直接吸收利用，在本试验中作为肥料对照进行研究。研究发现，施用MAP土壤灭菌与不灭菌处理间玉米生物量、植株磷吸收量均无显著差异。这一方面表明，土壤无病原菌等其他因素干扰，处理间差异仅受磷和土壤微生物的影响；另一方面表明，MAP肥效是由其本身性质决定。土壤微生物对植物吸收、利用MAP肥料中的磷素无显著作用的原因是本试验供磷量充足，植物根系能够直接吸收利用土壤中MAP提供的速效磷养分并转移到地上部。该结果与Chen等[52]研究结果相似，在高磷(60 mg/kg) 土壤中微生物对小麦磷吸收无显著影响，此时磷不是作物生长和微生物活性的限制因子。此外，磷养分充足时，存在土壤微生物与植物根系竞争磷素的现象。Van’t Padje等[53]研究发现，当加入充足的磷资源时，微生物会吸收磷素将其储存在体内，直到根系对磷资源需求增加再供给植物吸收。MAP处理的速效磷含量在灭菌情况下显著高于不灭菌处理，表明土壤微生物吸收固定了部分速效磷，也验证了这一观点。

土壤微生物对枸溶性磷肥CMP的利用率无显著影响。本研究发现，施用CMP高温灭菌与不灭菌土壤处理间的玉米地上部生物量、植株磷吸收量不存在显著差异。CMP作为枸溶性磷肥不能直接被作物吸收，需要依靠酸性物质通过化学溶解将其活化为磷酸根离子才能被作物吸收。大量研究表明，微生物分泌有机酸是溶解磷的主要机制[54]，常见有机酸包括柠檬酸、葡萄糖酸等[55]，有机酸的释放能够降低根际土壤的pH、促进磷释放[54]。通过ΔpH数据发现，土壤微生物显著降低了根际土壤Δ pH，对非根际土壤ΔpH无显著影响。推测是由于植物根系招募微生物并与其互作增加了酸性物质的分泌，从而显著降低了土壤ΔpH，而非根际土壤无根系作用，使得效应不显著。通过非根际土壤ΔpH可以发现，在不受微生物影响的石灰性土壤上施用碱性肥料会增加土壤ΔpH；根系释放酸性物质到根际，即使施用碱性肥料也降低了土壤ΔpH。综上所述，土壤微生物和植物根系通过分泌酸性物质，降低土壤pH促进枸溶性磷向速效磷的转化，但作用效果未能在生物量上表现出来。

土壤微生物显著提高了聚合态磷肥APP的利用效率。土壤微生物显著提高了APP处理的玉米地上部生物量、植株磷吸收量和根际土壤速效磷含量，分别增加了34.2%、41.2%、38.2%。灭菌条件下，聚合态磷肥APP处理的玉米生物量和植株磷吸收量显著低于MAP处理，不灭菌条件下无显著差异。这表明土壤微生物显著提高了APP的肥效，使其与MAP间无显著差异。进一步研究发现，微生物提高APP有效性可能归因于磷酸酶的作用[28]。APP水解一方面是溶解的化学过程 (磷酸盐组分)，另一方面是磷酸酶的生物过程 (焦磷酸盐等组分)[23,29]。其中，磷酸酶是显著影响APP水解的主要因素，如土壤微生物分泌的碱性磷酸酶。本研究发现，与不施磷肥处理相比，施用APP处理的碱性磷酸酶活性增加值高于其他处理。微生物数量、肥料底物诱导、土壤pH等均能影响碱性磷酸酶活性[56]。MAP、APP处理不灭菌处理土壤碱性磷酸酶活性增加值显著高于灭菌处理，这表明微生物数量越多碱性磷酸酶活性越高[41]；在微生物数量较多的不灭菌处理中，APP处理表现出了较高的活性且根际效应明显，推测是植物根系招募了更多的功能微生物以促进APP生物水解[29,56]。此外，土壤微生物显著降低了根际土壤ΔpH，推测是由于植物与土壤微生物互作分泌更多的酸性物质促进了APP水解。综上所述，土壤微生物对聚合态磷肥的作用表现为分泌碱性磷酸酶和酸性物质，促进聚合态磷酸盐的水解。未来将通过碱性磷酸酶 (phoD) 基因的引物扩增，分析功能土壤微生物基因的表达情况和群落组成。进一步通过分子生物学技术研究土壤微生物对APP作用的碱性磷酸酶机制。

4 结论

在磷用量为100 mg/kg条件下，MAP能够满足植物对磷素的需求，因此土壤微生物对MAP的转化未显现出明显作用。土壤微生物通过分泌酸性物质降低了根际土壤ΔpH，促进了CMP的活化，提高了植物磷吸收量。施用APP提高了与土壤微生物活性密切相关的土壤碱性磷酸酶活性，较高的磷酸酶活性促进了APP的水解，提高了土壤速效磷含量，进而促进了玉米对磷的吸收和利用。