金线莲分泌IAA内生真菌的筛选与鉴定及其发酵条件优化

陈科霖，王明元，尤长胜，刘建福，林萍，李雨晴，陈文亮

(1.华侨大学 化工学院，福建 厦门 361021；2.泉州市金胜生态农业有限公司，福建 泉州 362000)

金线莲(Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl)为兰科开唇兰属的一种多年生草本植物，具有清热凉血、除湿解毒的功效，以全草入药[1].金线莲含有多种生物活性化合物，如金线莲苷、多糖、黄酮和糖苷，常用于治疗肝病、糖尿病、高血脂和类风湿性关节炎[2-3].国内金线莲已被开发成各种不同剂型的产品，同时在临床上用于治疗手足口病和慢性肝炎[4].金线莲因其独特的药用和食用特性，市场需求逐年增加，但过度消费导致野生金线莲资源急剧减少.金线莲作为一种遮荫植物，对其小气候环境有着严格的要求.自然环境下，金线莲繁殖能力低，生存竞争力差[5-6]；而化学肥料的长期使用，会严重影响金线莲的可食性和安全性.

植物内生真菌具有改善和促进植物生长的能力[5，7-9]，是成功定居在维管植物组织中的微生物，据报道几乎在所有植物中都有分离[10].Berg等[11]发现内生菌直接影响一些植物的功能性状，如叶片营养水平、叶片寿命、比叶面积和地上部与根的比例.Cipriano等[12]在甘蔗上发现的促生菌具有固氮，促进植物激素产生的功能.李福艳等[13]筛选的3株真菌通过产生吲哚-3-乙酸(IAA)直接促进玉米幼苗生长.真菌分泌的IAA与内源植物的IAA协同反应，继而刺激植物生长.

目前，金线莲内生真菌促生菌株的研究已有报道，然而已发现的促生菌株依然有限，商业化应用菌株选择空间不多.因此，继续挖掘金线莲促生真菌资源是非常必要与迫切.本文从福建金线莲品种‘红霞’的茎中分离到一株产IAA能力较强的真菌PJ3，通过形态学特征及内部转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)基因序列分析进行鉴定，确定其为角担菌属，并优化其产IAA的发酵条件.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品来源及处理 金线莲品种‘红霞’来自福建省泉州金胜生态农业有限公司金线莲林下种植基地.从基地采集‘红霞’金线莲的完整植株，装盒，快速带回实验室，于4 ℃下保存.

1.1.2 培养基 LB液体培养基，pH=5.6～6.0；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，pH=5.6～6.0；产IAA培养基：L-色氨酸1 g，LB液体培养基定容至1 L；初始液体培养基：蔗糖20 g，无水硫酸镁0.5 g，无水磷酸氢二钾1.5 g，无水磷酸二氢钾1.5 g，蛋白胨10 g，去离子水定容至1 L，pH=5.6～6.0.

1.2 实验方法

1.2.1 内生真菌的分离纯化 取金线莲的根、茎、叶在流水下冲洗60 min，超净台下剪成0.5～1.0 cm小段，将各组织在75%乙醇下浸泡1 min；用1%升汞分别浸泡根部8 min，茎4 min，叶2 min，将片段浸入75%乙醇浸泡1 min.最后用无菌水清洗3次，并在灭菌滤纸上风干.将切好的根、茎、叶小段分别接种于PDA培养基内，于28 ℃恒温培养，待从根、茎、叶切口处长出菌后，挑取尖端进行纯化培养[14].

1.2.2 产吲哚乙酸(IAA)真菌的筛选及能力评估 将分离纯化后的菌株接入产IAA的培养基.培养条件：温度为28 ℃，摇床转速为180 r·min-1，培养时间为5～7 d.随后将菌悬液于12 000 r·min-1下离心10 min，取2 mL上清液，并加入等体积显示剂(Salkowski 比色液).对照组：等体积未接种LB液体培养基和Salkowski比色液混合液为阴性对照，室温黑暗下静置30 min，颜色不变色为阴性，不产IAA；变成粉红色则为阳性，产IAA，可进行IAA定量测定其D(530)值，每株菌试验设置3个平行[15].分别配置0.5，1.0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 μg·L-1分析纯的IAA系列浓度，并绘制标准曲线，最终IAA含量换算公式为

C=C1V1/V2.

上式中：C为样品吲哚乙酸浓度，μg·mL-1；C1为标准曲线上查得的IAA浓度，μg·mL-1；V1为样品提取液体积，mL；V2为样品反应液体积，mL.

1.2.3 菌株形态鉴定及ITS分子学鉴定 通过初步筛选，依据《真菌鉴定手册》[16]和《中国真菌志》[16]对促生效果最佳的菌株进行形态学鉴定，并进一步ITS序列分析和进化树分析.根据真核生物ITS保守序列通用引物ITS1(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[18]送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序.将测定所得序列与NCBI 数据库 BLAST 同源性比对分析，选取同源性较高的模式菌株用邻接法(neighbor-joining method)构建系统发育树.

1.2.4 菌株生长曲线绘制 在初始液体培养基上培养156 h，装液量(体积分数)为20%，置于28 ℃，180 r·min-1下，初始3 d每24 h取样1次，之后每12 h取样1次，测量菌株产IAA能力，并绘制曲线确定取样时间.

1.2.5 菌株发酵条件优化 1)分别选取葡萄糖、蔗糖、乳糖作为碳源和牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉作为氮源，置于28 ℃，180 r·min-1下培养4 d，测量其产IAA能力，每个处理设置3个重复；2)在最佳碳源、氮源下分别添加不同质量浓度的氮源或碳源，测量其产IAA能力，确定最佳添加量，每个处理设置3个重复；3)在优化培养基上 设置不同装液量(体积分数)、pH值和摇床转速，分别测量其产IAA能力，每个处理设置3个重复.

1.2.6 正交试验设计 通过单因素试验，设计5因素4水平正交试验，确定菌种产IAA的最佳条件.表1为正交试验设计表.表1中：ρC，ρN分别为碳源和氮源的质量浓度；φ为装液量(体积分数)；ω为摇床转速.

表1 正交试验因素与水平表

2 实验结果与分析

2.1 金线莲内生促生菌筛选

从‘红霞’金线莲的根、茎、叶中共分离16种内生真菌，只有PJ1，PJ3，PY2和PG5能够产IAA，如图1所示.图1中：ρIAA为IAA质量浓度.从图1可知：从茎中分离得到的PJ3产IAA能力最强，质量浓度达到(106.78±4.43)μg·mL-1，显著高于其他3个菌株.

图1 金线莲内生菌产IAA能力比较

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态鉴定 PJ3菌株在PDA培养基上的菌落形态和光学显微结构，如图2所示.由图2可知：PJ3菌株菌落覆盖密集的白色菌丝；菌落圆形，开始是白色，随后颜色逐渐加深变黄，最后为深褐色；光学显微镜下菌丝呈树枝状分布，分生孢子球形，无色透明.

(a)菌落形态A (b)菌落形态B (c)光学显微结构

2.2.2 PJ3菌株ITS分子鉴定 PJ3菌株的ITS 扩增后进行测序，将序列提交 GenBank 获得登录号 KM387384.根据数据库搜索进行BLAST比对.结果表明：PJ3菌株ITS基因序列与Ceratobasidiumsp.AG-V具有97.96%的相似性.选择已知的20种不同角担菌属序列，利用MEGA 7.0构建PJ3菌株的系统发育树，如图3所示.从图3的结果初步鉴定，菌株PJ3为角担菌属(Ceratobasidium)中的一员.

图3 基于ITS 基因序列构建的PJ3及相关菌株系统发育树

2.3 培养条件优化

2.3.1 培养时间 PJ3培养时间对菌株PJ3分泌IAA的影响，如图4所示.图4中：ρIAA为IAA质量浓度；t为培养时间.由图4可知：PJ3菌株在培养过程中，IAA质量浓度呈现先增加后稳定的趋势；从24 h到108 h，菌株快速产IAA；108 h时，PJ3菌株产IAA量达到最大值，为108.78 μg·mL-1，随后趋于稳定.因此，可以确定最佳取样时间为132 h.

图4 菌株产IAA浓度随着培养时间变化

2.3.2 碳源和氮源 不同碳源、氮源对菌株PJ3分泌IAA的影响，如图5所示.图5中：ρIAA，ρC，ρN分别为IAA和碳源(葡萄糖)、氮源(酵母浸粉)的质量浓度.

从图5(a)，(b)可知：当碳源为葡萄糖，其分泌IAA质量浓度最高，为122.61 μg·mL-1；不同葡萄糖添加量以15 g·L-1为最佳，IAA质量浓度高达124.81 μg·mL-1.从图5(c)，(d)可知：当氮源为酵母浸粉时，其分泌IAA质量浓度显著高于蛋白和牛肉膏组(P<0.05)，添加量为10 g·L-1时，最高达到193.36 μg·mL-1.综上所述，当碳源为葡萄糖，氮源为酵母浸粉时，菌株PJ3分泌IAA量最大.

(a)不同碳源 (b)碳源添加量

2.3.3 PJ3菌株发酵条件筛选 不同的装液量、pH值、摇床转速下，PJ3菌株分泌IAA能力如图6所示.图6中;φ为装液量(体积分数)；ω为摇床转速.从图6可知：装液量为28%时，PJ3菌株分泌IAA量显著高于其他组；pH值为6时，PJ3菌株分泌IAA量最佳，IAA质量浓度为182.59 μg·mL-1；摇床转速为180 r·min-1时，PJ3菌株分泌IAA量最佳，IAA质量浓度为181.62 μg·mL-1.

(a)装液量 (b)pH值 (c)摇床转速

2.3.4 正交试验结果分析 表2为正交试验设计表，表3为正交试验结果的极差分析.表2中：ρIAA为IAA质量浓度.从表2，3可知：5个因素对PJ3菌株分泌IAA的影响顺序为 B>C>D>E>A，最佳水平组合为A1B2C2D2E2，产量为193.59 μg·mL-1.

表2 正交试验设计表

表3 正交试验结果极差分析

IAA产量方差分析结果，如表4所示.从表4可知：B因素对PJ3菌株分泌IAA的影响显著高于其他几个因素.综合可知，最佳组合为A1B2C2D2E2，即1 L发酵培养基中含葡萄糖10.0 g、酵母浸粉15.0 g、装液量(体积分数)为28%，初始pH值为5，摇床转速为180 r·min-1.

表4 IAA产量方差分析

3 讨论

植物内生菌种类多样性取决于自身和寄主种类多样性，以及寄主不同部位分布的可选性[19].目前，关于金线莲内生菌分离的报道较少，研究主要集中在金线莲组织培养优化和药物成分分析上.植物内生菌对植物本身几乎无毒，通过生物控制和生物施肥，从根系进入植物体内并行使相关功能，因此，内生菌促进植物生长将更有效[20-21].

角担菌是一大类与陆生兰花形成共生关系的兰花菌根真菌(OMF)，对于种子萌发和维持兰花的自然种群至关重要[22].最近，Zhang等[22-23]发现Ceratobasidiumsp.AR2菌株和野生金线莲共培养促进了金线莲生长，并增加了黄酮类化合物和糖苷积累，但在我国关于角担菌属产IAA的能力鲜有报道.本研究从金线莲品种‘红霞’健康植株的茎中分离到1株内生真菌PJ3，经ITS序列及进化树分析鉴定菌株为Ceratobasidium.因此，推测该菌株能够促进金线莲品种‘红霞’的生长，检测发现其产IAA的特性较好，产量为106.78 μg·mL-1.

众多研究发现，优化促生菌发酵条件可以提高菌丝体生长量、IAA产量及促生效果[18].葛春辉等[15]和李引等[24]通过正交试验发现氮源是影响菌株产IAA的主要因素，Shokri等[25]也发现氮源是菌株产IAA的主要因素，并且当KNO3为氮源的IAA产率最高.本研究将PJ3产IAA产量作为重要考量指标，根据单因素试验和正交设计试验对其发酵条件进行优化，确定了菌株最优发酵条件为：葡萄糖10.0 g·L-1、酵母浸粉15.0 g·L-1、装液量(体积分数)为28%，初始pH值为5，摇床转速为180 r·min-1，试验结果比未优化前IAA产量提高了81.30%.此外，主要影响PJ3菌株产IAA的因素为氮源含量，本试验为金线莲的菌剂开发提供了一定的借鉴.