不同频率电针对AD模型大鼠干预及对NMDAR亚基基因表达的影响

王飞 高珊 汪伯毅 胡剑明 沈峰

(1武汉市第一医院针灸科，湖北 武汉 430022；2湖北中医药大学针灸骨伤学院；3武汉市第一医院中医部)

阿尔茨海默病(AD)导致患者认知、行为异常，在老年患者中发病率较高，患者主要临床表现为记忆力减退，认知困难，患者时间、空间定向能力部分丧失，性格寡僻冷漠，精神行为异常〔1〕。针灸治疗AD效果显著，作用机制是降低脑β-淀粉样蛋白(Aβ)表达，抑制神经元、突触细胞凋亡，有助于脑源性神经营养因子分泌，对神经元、突触损伤有一定的修复作用〔2,3〕。N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)属于一种兴奋性氨基酸受体，有研究证实，NMDAR在学习、记忆过程中发挥着重要作用〔4〕。本文旨在研究不同频率电针对AD模型大鼠的干预效果及对NMDAR亚基基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取雄性Wistar大鼠40只，4～5月龄，平均体重350～400 g，均由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2008-0005。所有大鼠在温度(22±2)℃，湿度55%环境中喂养1 w。

1.2方法

1.2.1模型建立 40只大鼠称重后使用10%水合氯醛注射，对大鼠给予腹腔麻醉，大鼠脑立体定位仪固定后，根据《大鼠脑立体定位图谱》确定大鼠海马区齿状回，原点为前囟，向后移动距离3.2 mm，中线旁开距离2.5 mm，向下深度3.5 mm，在大鼠颅骨上使用牙科钻进行钻孔〔5〕。使用磷酸盐缓冲液配置Aβ1～42溶液，浓度为1 μg/μl，在37℃中孵育1 w形成寡聚肽，使用5 μl微量注射器将Aβ1～42溶液注射至大鼠海马齿状回，分别在双侧注射5 μl溶液，速度为1 μl/min，在5 min内注射完成，留针5 min促进药物充分吸收，使用牙托粉将颅骨钻孔封闭，皮肤缝合后，使用碘酒消毒。假手术组10只大鼠，在大鼠双侧齿状回区注入5 μl 0.9%无菌生理盐水，其他与上述模型建立一致。所有建模成功的大鼠腹腔注射4×104U青霉素，连续注射3 d，避免感染发生。

1.2.2电针干预 模型组、2 Hz组、50 Hz组、假手术组，各10只。建模成功15 d后，对大鼠进行干预，选择大鼠百会穴、肾俞穴进行针刺：使用鼠套将大鼠固定，百会穴进针方式为针尖向前平刺，针刺角度保持15°，距离5 mm；肾俞穴进针方式为稍向内斜刺，针刺角度保持45°，距离5 mm。采用韩式电针仪(设置参数：连续波型，电流为1 mA)导线连接大鼠百会穴、肾俞穴，左右侧肾俞穴需要每天交替使用〔6〕。1次/d，7 d为1个疗程，连续治疗2个疗程。2 Hz组电针频率为2 Hz，50 Hz组电针频率为50 Hz。模型组和假手术组不做处理。

1.2.3行为学相关指标 采用WMT-100S水迷宫视频分析系统，进行定位航行实验：平台确定在第3象限中间，离水面距离1 cm，大鼠面向池壁从四个象限分别各放入水1次，统计大鼠隐藏到水面以下平台时间，时间在120 s内，即为逃避潜伏期。空间探索实验：将平台去除后，从原平台象限对侧象限将大鼠放入水中，观察大鼠游泳轨迹，时间在120 s内，记录大鼠在平台象限中逗留时间、跨越平台象限次数。

1.2.4海马区突触数目检测 大鼠断头处死后将颅骨快速剥离后，取出大鼠海马组织大小为1 mm3，放在2.5%的戊二醛固定液中固定保存，制作切片，环氧树脂包埋，染色后，透射电子显微镜下(日立HT7700)统计突触计数。

1.2.5Western印迹 将采集到的标本10 000 r/min离心10 min，取出上清液，采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白定量，将50 μg蛋白加入到2×十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶加样缓冲液中，100℃加热处理5 min促使蛋白变性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)完成后进行转膜，结束后取下硝酸纤维素膜，在5%脱脂牛奶中4℃下封闭1 h，封闭结束后，加一抗使用0.05%～0.10% TBST给予稀释〔突触素(SYN)、突触后致密蛋白(PSD)-95、β淀粉样前体蛋白(APP)、Aβ1～40、Aβ25～35一抗为1∶1 000〕，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次为5 min，加二抗使用0.05%～0.10% TBST给予稀释(1∶10 000)，室温摇动孵育1 h，最后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次5 min。采用二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒显色，光密度扫描后进行定量分析。以GAPDH为内参。

1.2.6NR1、NR2A、NR2B mRNA表达检测 采用荧光定量检测NR1、NR2A、NR2B基因表达，将采集到的标本，置于一次性真空无抗凝剂的采血管中，使用聚蔗糖(Ficoll)液分离单个核细胞。Trizol提取细胞RNA，经过电泳检测RNA并定量，经过逆转录合成cDNA。之后进行实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)，探针或SYBR 反应25 μl，反应条件：94℃ 5 min,94℃ 45 s,60℃ 1 min,40个循环,设置标准组和空白对照。将PCR实验前3～15个循环荧光信号作为荧光本底信号，调节基线，采用2-△△Ct分析NR1、NR2A、NR2B mRNA基因表达。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1不同频率电针对大鼠行为学相关指标的影响 与模型组相比，其余3组平均逃避潜伏期、首次跨越平台时间显著减少，跨越平台次数显著增加(P<0.05)。与假手术组相比，2 Hz组、50 Hz组平均逃避潜伏期、首次跨越平台时间显著增加，跨越平台次数显著减少(P<0.05)。50 Hz组平均逃避潜伏期、首次跨越平台时间显著低于2 Hz组，跨越平台次数显著高于2 Hz组(P<0.05)。见表1。

2.2不同频率电针对大鼠海马区突触数目的影响 与模型组相比，其余3组海马区突触数目均显著增加(P<0.05)。与假手术组相比，2 Hz组、50 Hz组海马区突触数目均显著降低(P<0.05)。50 Hz组海马区突触数目显著高于2 Hz组(P<0.05)。见表1。

2.3不同频率电针对大鼠海马区SYN、PSD-95表达的影响 与模型组相比，其余3组SYN、PSD-95表达均显著增加(P<0.05)。与假手术组相比，2 Hz组、50 Hz组SYN、PSD-95表达均显著降低(P<0.05)。50 Hz组SYN、PSD-95表达显著高于2 Hz组(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组行为学相关指标、海马区突触数目、SYN、PSD-95水平比较

2.4不同频率电针对大鼠海马区NR1、NR2A、NR2B mRNA的影响 与模型组相比，其余3组NR1、NR2A、NR2B基因表达显著升高(P<0.05)。与假手术组相比，2 Hz组、50 Hz组NR1、NR2A、NR2B基因表达显著降低(P<0.05)。50 Hz组NR1、NR2A、NR2B基因表达显著高于2 Hz组(P<0.05)。见表2。

图1 Western印迹检测SYN、PSD-95水平

表2 各组NR1、NR2A、NR2B mRNA影响

2.5不同频率电针对大鼠海马区APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白的影响 与模型组相比，其余3组APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白显著降低(P<0.05)。与假手术组相比，2 Hz组、50 Hz组APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白显著升高(P<0.05)。50 Hz组APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白显著低于2 Hz组(P<0.05)。见图2、表3。

图2 Western印迹检测APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白表达

表3 各组APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白表达比较

3 讨 论

AD主要的病理变化是由于Aβ累积引起老年斑发生，细胞内的Tau蛋白因为过度磷酸化导致神经纤维缠结，弥漫性神经元发生变性、缺失，严重会造成全脑萎缩〔7,8〕。我国人口老龄化现象越来越明显，并且随着患者年龄增加，AD发病率也随之升高〔9〕。

本研究结果说明50 Hz电针能有效改善大鼠学习记忆障碍，提高大鼠学习记忆能力。与沈晓艳等〔10〕研究结果保持一致。研究指出，AD发病及发展受突触丢失的影响，突触损伤是AD最早出现的病理变化，当AD发病时，突触退行性变快速恶化,主要分布在海马以及所有的皮质中〔11,12〕。本研究结果说明50 Hz电针对AD大鼠突触影响效果最明显。

SYN是一种与突触可塑性密切相关的蛋白，也是电针治疗脑病的重要标志物〔13〕。PSD-95与突触后可塑性具有相关作用〔14〕。本研究结果提示电针能提高大鼠学习记忆能力，其中50 Hz电针作用效果最强，调控SYN、PSD-95水平上调，有助于突触结构和功能重塑，起到改善AD学习障碍。NMDAR参与中枢神经系统发育及发展过程，NMDAR主要包括NR1、NR2亚基等类型，对钙离子具有较高的通透性，其中NR1作为基本亚基是构成离子通道的重要组成，NR2能有效提高NR1对兴奋性氨基酸作用〔15,16〕。NMDAR主要存在于海马区、大脑皮层、下丘脑等，参与中枢神经系统可塑性发育过程。Wang等〔17〕研究指出，NMDAR激动剂在维持、增加学习记忆发挥着重要作用。

APP来源于淀粉样前体蛋白，正常情况下对细胞无影响，在多种组织中均有表达，尤其是在脑、肾、心肌等组织中表达水平相对较高。Kumar等〔18〕研究指出，APP对神经元可塑性具有一定抗炎作用，在蛋白质裂解酶作用下形成Aβ，从而破坏细胞。APP通过γ酶异常切割，形成Aβ1～40、Aβ25～35蛋白，是淀粉样斑主要有效成分，会提高毒性，损伤神经元，Aβ沉积是AD发病的主要原因〔19〕。本研究结果提示50 Hz频率电针对AD模型大鼠干预效果最为显著，避免Aβ过度累积，降低神经毒性作用。与刘若兰等〔20〕研究结果保持一致。