黄精九蒸九晒炮制过程中药效化学成分动态变化

郭涛，王荣靖，宋艺君，叶建，焦慧，于代杰，常晖

(1.空军第九八六医院，陕西 西安 710054；2.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；3.陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710075)

黄精为百合科植物黄精(PolygonatumsibiricumRed.)、多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHua)、滇黄精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)的干燥根茎[1]，始载于《名医别录》，被列为上品。生黄精味甘性平，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效。生黄精具麻味，刺人咽喉。蒸后补脾、润肺、益肾的功能增强，并可除去麻味，以免刺激咽喉。用于脾胃虚弱，肺虚燥咳，肾虚精亏。如治肾虚精亏、头晕足软的枸杞丸[1]。酒黄精能助其药势，使其滋而不腻，更好地发挥补益作用。如用于治疗气血两亏的九转黄精丹及用于肾虚阳痿，梦遗滑精的海马保肾丸[1]。黄精主要含多糖、皂苷、生物碱、木脂素、黄酮、植物甾醇以及挥发油等成分[2-3]，具有抗氧化抗衰老、抑制老年痴呆和改善学习记忆、降血糖、抗动脉粥样硬化、抗菌抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等药理作用[4-5]。近年来，黄精生品对咽喉的刺激性受到人们的重视，研究发现[6-8]，黄精炮制品与生品在化学特征、药效、刺激性方面均存在较大差异。

九蒸九晒又称九蒸九曝[9-10]，是古代常用的一种传统炮制方法。该法起源于南朝《雷公炮炙论》中的“单蒸法”，到唐《千金翼方》的“双蒸法”，在不同特性药物应用之后，“九蒸九晒”炮制法逐步形成。黄精是“四大九蒸货”之一。唐代，《食疗本草》首次提出九蒸九晒炮制黄精，记载：“取瓮子去底，釜上安置令得，所盛黄精令满；密盖，蒸之。令气溜，即曝之。第二遍蒸之亦如此，九蒸九曝”。宋代，《日华子诸家本草》云：“黄精单服，九蒸九曝，食之驻颜断谷”。明代，《本草原始》云：“黄精去须，九蒸九晒用，每蒸一次，必半日方透”。清代，《青阳县志》云：“以天然黄精为原料，经过九蒸九晒，成品内赤外黄，味香甜”。传统认为，九蒸九晒后的黄精，一方面药性发生改变，有效成分累积，可增强其补脾润肺、温补肾阳的作用；另一方面可消除生黄精的刺激性，认为[11]生黄精含有的黏液质会刺激咽喉，通过反复蒸晒，黏液质被分解，从而消除生黄精的刺激性，达到减毒的目的。

随着现代饮片行业大生产的发展，黄精炮制工艺逐步简化，现在多采用一蒸一晒法。在《中国药典》2020年版，采用酒蒸或酒炖的炮制方法，与传统的九蒸九晒炮制方法差异很大[12-14]。本文基于黄精“九蒸九晒”的传统炮制方法，以黄精中多糖、总皂苷、5-羟甲基糠醛(5-HMF)和浸出物含量为评价指标，对其炮制过程中主要化学成分的动态变化规律进行分析，意欲深入探究黄精九蒸九晒的炮制机制，以揭示黄精炮制过程内在质量变化规律和最佳炮制方法，进一步阐明黄精现代炮制方法简化的合理性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 SP-1920型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦有限公司)；MS105型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 试药 黄精药材购自陕西汉中黄精基地，经陕中医药学院胡本祥教授鉴定为百合科植物黄精(PolygonatumsibiricumRed.)的干燥根茎。葡萄糖对照品(批号：110833-201707，纯度：99.9%)、5-HMF对照品(批号：111626-201711，纯度：99.2%)、薯蓣皂苷对照品(批号：112809-201904，纯度：99.9%)均购于中国食品药品检定研究院；黄酒(绍兴黄酒酿造有限公司，批号：20191202)；甲醇采用色谱纯，水采用纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄精不同炮制程度样品的制备 清蒸-九蒸九晒制黄精[12,15]：取生黄精，蒸锅蒸制6 h，熄火闷润一夜(8 h)，次日取出置60 ℃烘箱至外皮微干，为蒸晒一次的制黄精，反复9次蒸晒，分别得到蒸晒不同次数的制黄精。切制，干燥，依次记为M1～M9。

酒蒸-九蒸九晒制黄精[12,15]：取生黄精，加黄酒拌匀(黄酒和药材的配比为20∶100)，待黄酒吸收后，按清蒸-九蒸九晒制黄精的制法操作得到样品，依次记为MC1～MC9。第一次蒸制黄酒用量为黄酒总量的20%，以后每次蒸制黄酒用量为黄酒总量的10%。

2.2 多糖定量测定[16]

2.2.1 对照品溶液的制备 取葡萄糖对照品24 mg，精密称定，置量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.48 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品细粉0.25 g，精密称定，放置圆底烧瓶中，将80%乙醇150 mL加入，置水浴中加热回流1 h，滤过，将剩余残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，然后将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150 mL，沸水浴中加热回流1 h，趁热滤过，将残渣及烧瓶用热水洗涤4次，合并滤液与洗液，转移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。

2.2.3 最大吸收波长的确定 取“2.2.1”“2.2.2”项下对照品溶液200 μL、供试品溶液2 mL，按“2.2.4”项下方法显色，以相应试剂为空白，分别将上述对照品和供试品溶液在分光光度计全波长扫描，结果对照品和供试品均在583 nm处出现最大吸收。故选择波长583 nm进行检测。

2.2.4 线性关系考察 精密量取500、400、300、200、100、50 μL对照品溶液，分别置10 mL具塞刻度试管中，加水至2.0 mL，摇匀，冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，摇匀，放冷后98 ℃水浴保温10 min，取出，置0 ℃冰水浴冷却10 min，取出，以相应试剂为空白，按照可见分光光度法(通则0401)，在583 nm波长处依法测定吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=7.745 4X+0.003 2，r=0.999 9。试验结果表明，葡萄糖在2.4～24.0 μg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取同一供试品溶液(M1)，精密吸取2 mL，按“2.2.4”项下条件测定吸光度，重复测定6次，结果RSD为0.61%，表明本方法精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液(M1)，精密吸取2 mL，按“2.2.4”项下测定方法，分别在样品制备好后0、10、20、30、40 min测定吸光度，得到RSD为0.79%，表明供试品溶液在40 min内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一样品(M2)6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每份供试品溶液精密吸取1 mL，按照2.2.4项下方法测定吸光度，得到RSD为3.11%，表明本方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取已知多糖含量的样品9份，每份0.125 g，按照样品多糖含量的120%、100%、80%依次加入葡萄糖对照品溶液，每个质量浓度平行3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并测定吸光度，得到平均回收率为98.42%，RSD为1.14%，结果表明本方法回收率良好。

2.2.9 样品测定 取“2.2.2”项下制备的M1～M9及MC1～MC9供试品溶液，依法进行测定，结果见表1，多糖含量变化趋势见图1。

表1 黄精中各类成分随蒸晒次数的动态变化情况(n=3)

图1 黄精九蒸九晒过程中多糖的含量变化趋势

由表1、图1可以看出，经过9次蒸晒后，总体来说黄精饮片中多糖含量下降，对于清蒸-九蒸九晒黄精和酒蒸-九蒸九晒黄精减量分别达到23.8%和20.5%；伴随黄精蒸晒次数的增加，对于清蒸-九蒸九晒黄精和酒蒸-九蒸九晒黄精，其多糖含量呈现先上升后下降趋势；清蒸-九蒸九晒黄精多糖含量先呈逐渐增大趋势，第四次蒸晒后多糖含量达到最大值，其后五蒸含量降低，而且清蒸和酒蒸两组含量变化一致，两者在第九次蒸晒后多糖含量仍符合药典要求。

2.3 总皂苷定量测定[17]

2.3.1 对照品溶液的制备 取薯蓣皂苷对照品3.75 mg，精密称定，置10 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.375 mg·mL-1的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取黄精粉末1 g，加15倍量80%乙醇，超声30 min(2次)，过滤，合并滤液至50 mL容量瓶，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

2.3.3 最大吸收波长的确定 取“2.3.1”“2.3.2”项下所得样品溶液30 μL、对照品溶液200 μL，水浴蒸干，按“2.3.4”项下方法显色，以相应试剂为对照，分别将上述样品和对照品溶液在分光光度计全波长扫描，结果样品和对照品均在485 nm有最大吸收。故选择检测波长485 nm。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液500、400、300、200、100、50 μL，置具塞刻度试管中，水浴挥干，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀，60 ℃水浴加热15 min，然后冰浴5 min，取出，加5 mL冰醋酸，以相应试剂为空白对照，于485 nm处测定吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，薯蓣皂苷质量浓度(X)为横坐标作标准曲线，得回归方程Y=5.678 6X+0.004 7，r=0.999 9，试验结果表明，总皂苷在3.13～31.25 μg·mL-1范围内与吸光度有良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验 取对照品溶液，按照“2.3.4”项下条件测定吸光度，重复测定6次，结果RSD为0.52%，试验结果表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取供试品溶液M1，精密吸取200 μL，按“2.3.4”项下方法，分别在样品制备好后0、10、20、30、40 min测定吸光度，得到RSD为0.68%，表明供试品溶液在40 min内基本稳定。

2.3.7 重复性试验 取同一样品(M2)6份(每份1 g)，按照2.3.2项下方法制备供试品溶液，每份精密吸取200 μL，按照“2.3.4”项下条件测定吸光度，得到RSD为2.08%，表明本方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取平行样品9份(已知总皂苷含量)，每份0.5 g，按照样品总皂苷含量的80%、100%、120%依次加入薯蓣皂苷对照品溶液，每个质量浓度平行3份，按照“2.3.2”项下方法制备供试品并测定吸光度，得到平均回收率为97.92%，RSD为1.14%，结果表明本方法回收率良好。

2.3.9 样品定量测定 取“2.3.2”项下制备的M1～M9及MC1～MC9供试品溶液，依法进行测定，结果见表1，总皂苷含量变化趋势见图2。

图2 黄精九蒸九晒过程中总皂苷的含量变化趋势

从图2和表1可以看出，随着黄精蒸晒次数的增加，总皂苷含量呈缓慢下降趋势，第九次炮制品与第一次炮制品比较，清蒸-九蒸九晒黄精和酒蒸-九蒸九晒黄精减量分别达到37.0%和38.9%；从一蒸一晒到四蒸四晒，酒蒸黄精的总皂苷含量均高于清蒸黄精，而从五蒸五晒到九蒸九晒，清蒸黄精总皂苷含量均高于酒蒸黄精。

2.4 5-HMF定量测定[18]

2.4.1 色谱条件 Hypurity C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：30 ℃，流动相水-甲醇(92∶8)，流速：1.0 mL·min-1，检测波长：280 nm，进样量：10 μL。5-HMF对照品和样品的HPLC图谱见图3。

A.对照品；B.样品 1.5-HMF图3 5-HMF色谱图

2.4.2 对照品溶液的制备 取5-HMF对照品，精密称定，加甲醇溶解得到100 μg·mL-1的对照品溶液。取上述5-HMF对照品1 mL，用甲醇稀释定容至5 mL容量瓶，得到20 μg·mL-1的对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取样品0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，加入80%甲醇25 mL，称重，水浴加热回流1 h，放冷，二次称重，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4.4 线性关系考察 取对照品溶液(“2.4.2”项下)，依次取80、40、20、10、5、2 μL进样，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)绘制标准曲线，得到方程Y=7×106X-47 497，r=0.999 8，结果表明5-HMF在0.04～1.6 μg范围内与峰面积有良好线性关系。

2.4.5 精密度试验 吸取对照品5-HMF溶液10 μL，按“2.4.1”项下方法连续进样6次，得到5-HMF峰面积的RSD为0.72%，表明本方法精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 按“2.4.3”项下方法制备M1供试品溶液，分别在样品制备好后0、4、8、12、24 h依法测定，结果得到5-HMF峰面积的RSD为0.78%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性试验 取M2样品6份(每份0.2 g)，按照“2.4.3”项下条件制备供试品溶液，依法测定峰面积，得到5-HMF峰面积的RSD为1.22%，表明本方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验 取已知5-HMF含量的样品9份(每份0.1 g)，按照5-HMF含量的120%、100%、80%，分别加入一定量的对照品溶液，每个质量浓度平行3份，按“2.4.3”项下条件制备供试品溶液，测定峰面积，得到平均回收率97.82%，RSD为1.31%，结果表明本方法回收率良好。

2.4.9 样品定量测定 取“2.4.3”项下制备的M1～M9及MC1～MC9供试品溶液，依法测定，结果见表1，5-HMF含量变化趋势见图4。

图4 黄精九蒸九晒过程中5-HMF的含量变化趋势

由表1、图4可以看出，经过九次蒸晒后，总体来说黄精饮片中5-HMF含量上升，对于清蒸-九蒸九晒黄精和酒蒸-九蒸九晒黄精增量分别达到5倍多和8倍；伴随黄精蒸晒次数的增加，对于清蒸-九蒸九晒黄精和酒蒸-九蒸九晒黄精，其5-HMF含量先呈逐渐增大趋势，六蒸六晒后5-HMF含量达到最大值，最后三蒸含量降低，至第九次蒸晒后5-HMF含量分别为0.49%和0.48%。

2.5 浸出物定量测定[16]按照《中国药典》2020年版(四部)2201项下(浸出物测定的热浸法)依法测定醇溶性浸出物。测定结果见表1，浸出物含量变化趋势见图5。

图5 黄精九蒸九晒过程中浸出物的含量变化趋势

由表1、图5可以看出，伴随黄精蒸晒次数的增加，其浸出物的含量变化无明显规律，且大致保持在一定范围内。此外，黄精每蒸晒一次制得的炮制品均可达到《中国药典》2020年版要求。

3 讨论

本文较系统分析了黄精清蒸和酒蒸品从一蒸一晒到九蒸九晒成品炮制全过程，测定不同炮制程度制黄精中多糖、总皂苷、5-HMF和浸出物的含量，从而评价黄精九蒸九晒的炮制终点。结果表明黄精在六蒸六晒后已达到传统外观质量要求，也符合现行版《中国药典》性状要求，黄精中这几类成分在六蒸六晒时达到拐点，后逐渐趋于稳定。六蒸六晒品与一蒸一晒品相比，多糖含量升高，5-HMF含量最高，总皂苷含量降低，浸出物含量基本不变。因此从多糖、5-HMF和总皂苷含量的角度上，六蒸六晒品既是黄精炮制过程中的拐点，又是九蒸九晒的终点，但其药理作用和临床功效是否与九蒸九晒黄精、生品黄精存在差异，有待进一步深入研究。

黄精九蒸九晒品的炮制要反复蒸制，以“亮如油，色如漆，甘如饴”为传统经验指标[10]。九蒸九晒炮制方法虽然会导致多糖含量降低，但却是黄精的传统经典炮制方法，而《中国药典》2020年版仅规定以多糖作为其含量限度指标，其方法专属性差，难以反映黄精的真实质量[19]。因此，在黄精九蒸九晒炮制过程中，如何控制蒸制时间、次数等，是优先把握蒸制时间的长短还是优先把握蒸制次数，并结合黄精炮制过程中其他成分的变化，来制定其质量控制标准，需要进行进一步深入研究。