液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法鉴定阿尔泰金雀花中21种黄酮类化合物

袁洁，古丽斯坦·阿不来提，布比阿加尔·哈依拉提，姚军，程煜凤*

(1.新疆第二医学院，克拉玛依 834000；2.新疆医科大学 第五附属医院，乌鲁木齐 830011；3.新疆医科大学 药学院，乌鲁木齐 830011)

金雀花(Caragana sinicaRehd.)是蝶形花亚科锦鸡儿属(CaraganaFabr.)植物阿尔泰锦鸡儿(Caragana altaicaKom.Pojark)干燥成熟的花，生长于新疆阿勒泰地区海拔1 000 m以下的灌木丛、山坡、谷地中[1-3]，其作为一种民间药材，常用于治疗劳热咳嗽、虚损、妇科疾病、高血压和关节炎等[4]。本课题组研究发现，阿尔泰金雀花中富含黄酮类化合物成分，大鼠试验显示其对高血压有很好的防治作用[5]，但药效物质基础尚不明确。因此，对阿尔泰金雀花中黄酮类化合物成分的研究具有重要意义。而目前，国内外对金雀花中黄酮类化合物成分研究较少，本课题组采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)，鉴定了金雀花乙醇提取物中9种黄酮苷类化合物[6]；文献[7]根据化合物的理化性质和波谱数据，鉴定了金雀花乙醇提取物中6种黄酮类化合物，还有大量的其他黄酮类化合物有待分析。

近年来，液相色谱-质谱联用技术已成为中药化学成分分析的主要手段，静电场轨道阱高分辨质谱仪因分辨率高、扫描快速、灵敏度高等优点，可同时准确采集母离子的质荷比(m/z)和碎片离子的质量数，实现单针进样即可获取中药中不同化学成分的详细信息[8-10]，被广泛应用于缺乏对照品的复杂中药体系中化学成分的定性鉴定。鉴于此，本工作采用液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法(LC-Orbitrap HRMS)分析阿尔泰金雀花中21 种黄酮类化合物，根据保留时间、一级质谱、二级质谱等信息进行结构鉴定，为探讨阿尔泰金雀花的药效物质基础提供理论依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Orbitrap Fusion Lumos型高分辨液相色谱-质谱联用仪；AB135-S型电子分析天平；Milli-Q 型超纯水仪；KQ-500DE 型数控超声波清洗器；OSB-2100型旋转蒸发仪。

乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯；其余试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Waters C18色谱柱(250 mm×3.0 mm，5μm)；柱温25 ℃；流动相A 为乙腈，B为0.2%(体积分数，下同)甲酸溶液；流量0.3 mL·min－1；进样量5μL。梯度洗脱程序：0～25 min时，A 由15%升至50%。

2)质谱条件 电喷雾离子(ESI)源，负离子模式；扫描范围m/z100～1 100；干燥气为氮气，干燥气温度300 ℃，干燥气流量30 L·min－1；毛细管电压30 V；雾化器压力345 k Pa；碰撞诱导解离能量45 e V。

1.3 试验方法

按本课题组前期优化的工艺条件制备金雀花乙醇精提物[11-12]，即将干燥后的阿尔泰金雀花粉碎后过孔径为0.425 mm(40目)的筛网，称取过筛后的样品20.0 g，按料液比1 g∶50 mL 加入60%(体积分数)乙醇溶液，设定超声功率为300 W，水浴温度为60 ℃，超声提取50 min，经抽滤、减压浓缩、干燥后得粗提物。采用AB-8型大孔吸附树脂对金雀花粗提物进行纯化，将粗提液(1.14 g·L－1[12])按2.8 BV 的柱床体积、2.5 mL·min－1的流量进样，进行树脂吸附，再用70%(体积分数)乙醇溶液以2.0 BV 的柱床体积、3.0 mL·min－1的流量进行洗脱，收集洗出液，减压浓缩、干燥后得到金雀花精提物。准确称取金雀花精提物5 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.22μm 微孔滤膜过滤，得到供试品溶液，按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱及质谱条件的优化

试验考察了不同流动相体系[乙腈-2%(体积分数，下同)甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、甲醇-2%甲酸溶液]对21种黄酮类化合物分离效果的影响。结果显示：以乙腈-2%甲酸溶液、甲醇-2%甲酸溶液为流动相体系时，色谱峰拖尾严重，分离度较小，分离效果不理想；以乙腈-0.2%甲酸溶液为流动相体系进行梯度洗脱时，各目标物分离效果较好。因此，试验选择流动相体系为乙腈-0.2%甲酸溶液。

试验进一步比较了电喷雾离子源正、负离子(ESI＋、ESI－)模式下，供试品溶液的总离子流色谱图，发现负离子模式下各目标物的色谱峰响应值更高。因此，质谱分析采用ESI－模式进行扫描，所得总离子流色谱图见图1。

图1 阿尔泰金雀花的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of Altai Caragana sinica

2.2 化合物结构鉴定

按照仪器工作条件对供试品溶液进行分析，根据一级质谱图确定化合物精确相对分子质量，结合Xcalibur4.2软件拟合的分子式及MassBank 等数据库，对各色谱峰进行初步推断；通过分析二级质谱信息，比对国内外参考文献，分析推导相关化合物的裂解规律，各项数据信息之间进行相互验证，推断出化合物的结构。共解析出21种黄酮类化合物，结果见表1。

表1 21种黄酮类化合物鉴定分析Tab.1 Identification analysis of 21 flavonoid compounds

表1(续)

2.3 化合物裂解规律分析

根据金雀花精提物的二级质谱信息，以化合物1，3，10，11，13，14为例对裂解规律进行分析，结果如下。

化合物1(保留时间为2.58 min)和化合物3(保留时间为5.68 min)的准分子离子峰[M-H]－基本一致，分别为m/z755.200 62和m/z755.199 95，初步推断苷元为槲皮素，糖为两分子鼠李糖和一分子葡萄糖或一分子半乳糖；结合二级质谱信息及文献[13]，推断两个化合物为槲皮素-3-O-洋槐糖-7-O-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-鼠李糖苷；由于葡萄糖苷类化合物的出峰时间比半乳糖苷类化合物的晚，因此推断化合物1 为槲皮素-3-O-洋槐糖-7-O-鼠李糖苷，化合物3为槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-鼠李糖苷。以化合物3为例进行质谱解析，碎片离子m/z609.144 65为7-O苷键裂解后失去一分子鼠李糖基的槲皮素-3-O-鼠李糖(1→6)半乳糖苷片段，碎片离子m/z446.084 35为3-O苷键裂解后失去一分子芸香糖基的槲皮素-7-O-鼠李糖苷片段；当失去所有糖基时，可形成m/z299.019 41的槲皮素苷元离子。化合物3的裂解途径见图2。

图2 槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-鼠李糖苷的裂解途径Fig.2 Fragment pathway of quercetin-3-O-rutinoside-7-O-rhamnoside

化合物10(保留时间为11.54 min)和化合物11(保留时间为11.69 min)的准分子离子峰[M-H]－基本一致，分别为m/z463.086 12 和m/z463.086 15，初步推断苷元为槲皮素，糖为一分子半乳糖或一分子葡萄糖；结合二级质谱信息及文献[16]，推断两个化合物为金丝桃苷和异槲皮苷；由于半乳糖苷类化合物比葡萄糖苷类化合物出峰时间早[23]，推断化合物10为金丝桃苷，化合物11为异槲皮苷。

以化合物11为例进行质谱解析，碎片离子m/z300.027 34为3-O苷键裂解后丢失了一分子中性葡萄糖的槲皮素苷元部分；槲皮素苷元部分丢失HCO 后形成m/z271.024 87的碎片离子，亦可丢失一分子CO 和一分子OH 后形成m/z255.029 79的碎片离子，还可丢失 C7H5O2形成m/z178.998 40的碎片离子，继续丢失CO 形成m/z151.003 39的碎片离子。化合物11的裂解途径见图3。

图3 异槲皮苷的裂解途径Fig.3 Fragment pathway of isoquercitrin

化合物13(保留时间为13.05 min)和化合物14(保留时间为13.34 min)的准分子离子峰[M-H]－基本一致，分别为m/z477.101 62 和m/z477.101 84，初步推断苷元为异鼠李素，糖为一分子半乳糖或一分子葡萄糖；结合二级质谱信息及文献[11]，推断化合物13为异鼠李素-3-O-半乳糖苷，化合物14为异鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

以化合物14为例进行质谱解析，碎片离子m/z357.061 37为母离子m/z477.101 84中葡萄糖裂解丢失C4H8O4后形成的部分，母离子m/z477.101 84亦在3-O苷键裂解后丢失了一分子中性葡萄糖，从而形成碎片离子m/z314.042 85，该碎片离子进一步丢失中性分子CH3或中性分子CO，形成碎片离子m/z299.019 68或m/z286.048 25，亦可同时丢失CH3和CO，形成碎片离子m/z271.024 78。化合物14的裂解途径见图4。

图4 异鼠李素-3-O-葡萄糖苷的裂解途径Fig.4 Fragment pathway of isorhamnetin-3-O-glucoside

2.4 化合物结构验证

以化合物12，15，21为例，验证试验结果的可靠性。化合物12 的准分子离子峰[M-H]－为m/z623.158 81，碎片离子包括m/z477.102 08、m/z315.050 38、m/z300.027 62、m/z271.024 99、m/z243.029 59、m/z151.003 27；已报道的水仙苷对照品的[M-H]－为m/z623.156 6，主要碎片离子包括m/z315.050 8、m/z300.028 2、m/z271.027 2、m/z243.033 3、m/z151.007 6[17]，两者的信息基本一致，因此确定化合物12为水仙苷。化合物15的准分子离子峰[M-H]－为m/z253.049 87，碎片离子包括m/z225.055 15、m/z209.060 21、m/z135.008 12、m/z117.033 93；已报道的7，4′-二羟基黄酮对照品的[M-H]－为m/z253.05，主要碎片离子包括m/z135.01、m/z117.04[18]，两者的主要质谱数据基本一致，因此确定化合物15为7，4′-二羟基黄酮。化合物21的准分子离子峰[M-H]－为m/z315.049 93，碎片离子包括m/z300.027 16、m/z272.032 75、m/z151.003 00、m/z107.013 85；已 报道的异鼠李素对照品的[M-H]－为m/z315.1，主要碎片离子包括m/z300.1、m/z151.0[22]，两者的关键质谱信息基本一致，因此确定化合物21为异鼠李素。

本工作采用LC-Orbitrap HRMS 对阿尔泰金雀花中的黄酮类化合物进行分析，共鉴定出21种黄酮类化合物。该研究为金雀花中黄酮类化学成分的定性鉴定提供了一种准确、快速、高效的分析方法，同时为进一步明确阿尔泰金雀花的药效物质基础提供了试验依据。

本工作中液相色谱-质谱联用图谱由中国科学院北京化学研究所刘健安工程师测试、提供，在此表示衷心感谢。