固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定废水中12种抗生素的含量

郭文建，张慧，王桂勋，朱晨，李琳，李红莉，孙俊玲

(山东省生态环境监测中心，济南 250101)

抗生素具有抗菌和抑菌作用，是药物和个人护理用品的重要组成部分，有效地保障了人们的生命健康[1]。但是，一些抗生素还被大量用于畜牧业和水产养殖业，出现了严重的滥用现象[2-3]。抗生素被动物和人体吸收后，只有极少部分通过新陈代谢生成无活性产物，大部分会以原药的形式随粪尿排出，进入环境中[4-5]。大多数抗生素极性强、易溶于水、不易挥发，在环境中主要通过水相传递和食物链扩散。水环境中的抗生素主要来源于人类及兽用药、农牧渔养殖废水、生产废水或医院废水等[6]，这些废水会进入污水处理厂，经过处理，仅少数抗生素可被去除，而大量抗生素最终会直接流入自然水体中，进而危害人类身体健康[7]。因此，测定废水中抗生素的含量尤为重要。

近年来，测定抗生素的方法主要有高效液相色谱法[8-9]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[10-14]，但是高效液相色谱法无法克服基质干扰，在多组分同时测定时存在一定困难；LC-MS/MS具有更高的灵敏度和选择性，能够有效地克服基质干扰，适合多组分的同时测定。另外，文献报道的方法大多只测定了一种或同类的几种抗生素，并且研究对象多集中于河流、湖泊等自然水体，对医院废水、工业废水的研究较少。由于废水成分复杂，余氯、过氧化氢等氧化性物质会对部分种类抗生素的测定产生干扰，测定难度大，因此本工作提出了固相萃取-LC-MS/MS测定废水中磺胺类[磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺甲口恶唑(SMZ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)]、喹诺酮类[诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFX)、氟罗沙星(FLE)]、大环内酯类[脱水红霉素(ERY-H2O)、罗红霉素(ROX)、螺旋霉素(SPM)]等3大类12种抗生素含量的方法，为开展废水中抗生素残留分析及风险评估提供了一定的参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 6460 型三重四极杆液相色谱-质谱联用仪；Auto Trace 280 型全自动固相萃取仪；TurbovapⅡ型有机样品浓缩仪；Millipore型超纯水机；Waters Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL)。

抗生素单标准溶液：100 mg·L－1，称取12种抗生素标准品各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成质量浓度为100 mg·L－1的抗生素单标准溶液，于－10 ℃以下避光保存。

混合标准储备溶液：移取适量的12种抗生素单标准溶液，用甲醇稀释并定容至100 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1.00 mg·L－1的混合标准储备溶液。使用时，用甲醇稀释至所需质量浓度。

内标溶液：2.00 mg·L－1，称取阿特拉津-13C3标准品0.02 g，用甲醇稀释并定容至100 mL 容量瓶中，配制成质量浓度为200 mg·L－1的内标储备溶液，于－10 ℃以下避光保存。使用时，用甲醇稀释至2.00 mg·L－1。

流动相A：取0.5 mL甲酸置于500 mL容量瓶中，用体积比为1∶1 的甲醇-乙腈混合液定容，混匀，备用。

流动相B：取0.5 mL甲酸置于500 mL 容量瓶中，用水定容，混匀，备用。

稀释溶剂(初始比例流动相)：取25 mL流动相A 和75 mL流动相B 于100 mL 容量瓶中，混匀，备用。

SMM 标准品的纯度为98.0%、SD 标准品的纯度为99.0%、SDM 标准品的纯度为99.0%、SMZ标准品的纯度为99.5%、SM2 标准品的纯度为99.6%、NOR 标准品的纯度为99.1%、CIP标准品的纯度为99.2%、OFX 标准品的纯度为99.0%、FLE标准品的纯度为98.0%、ERY-H2O 标准品的纯度为97.0%、ROX 标准品的纯度为97.0%、SPM标准品的纯度为97.0%、阿特拉津-13C3标准品的纯度为99.0%。

乙腈、甲醇均为色谱纯；甲酸为质谱纯；乙二胺四乙酸二钠、抗坏血酸、盐酸、硫代硫酸钠均为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ZARBAX Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm×4.6 mm，1.8μm)；柱温40℃；进样体积20μL；流量0.3 mL·min－1；流动相A 为体积比为1∶500∶500的甲酸-甲醇-乙腈混合液，B 为0.1%(体积分数)甲酸溶液。梯度洗脱程序：0～2 min 时，A 为25%；2～18 min 时，A 由25%升至60%，保持2 min；20～21 min 时，A 由60%降至25%，保持4 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源，正离子模式；毛细管电压4 000 V；干燥气温度350 ℃；干燥气流量10 L·min－1；雾化器压力241.3 k Pa；多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表1，其中“*”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

取水样500 mL，用6 mol·L－1盐酸溶液调节水样酸度至pH2.0～4.0后，再加入150 mg抗坏血酸和250 mg乙二胺四乙酸二钠。将上述溶液注入经5 mL甲醇、5 mL水、5 mL pH2.0的盐酸溶液活化的固相萃取柱中，以10～15 mL·min－1流量全部通过萃取柱后，用5 mL 水进行淋洗，弃去流出液，再用氮气吹扫20 min，然后分两次加入10 mL甲醇，以5 mL·min－1流量进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液经氮吹仪浓缩至近干，加入内标溶液25μL，用稀释溶剂定容至1.0 mL，经0.22μm 有机滤膜过滤，滤液供LC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

移取适量的抗生素混合标准储备溶液和内标溶液，用稀释溶剂稀释，配制成12种抗生素质量浓度均为100μg·L－1、内标质量浓度为50μg·L－1的混合标准溶液。按照仪器工作条件，对上述溶液进行测定，所得总离子流色谱图见图1。

图1 总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram

2.2 固相萃取柱的选择

试验考察了C18(500 mg/6 mL)和 HLB(500 mg/6 mL)两种固相萃取柱对空白加标水样(加标量100 ng·L－1)中12种抗生素回收率的影响，结果见图2。

图2 固相萃取柱对12种抗生素回收率的影响Fig.2 Effect of solid phase extraction column on recovery of 12 antibiotics

结果表明：选用C18固相萃取柱时，喹诺酮类及大环内酯类抗生素的回收率明显偏低，而选用HLB固相萃取柱时，各目标物的回收率普遍更高，这可能是由于喹诺酮类抗生素具有4-氧代喹啉-6-氟-3-羧基结构，亲水性较好，大环内酯类抗生素的亲脂性较好，而C18固相萃取柱的填料具有疏水特性，适用于萃取、净化和富集非极性到中等极性的化合物；HLB固相萃取柱的填料为亲水亲脂型聚合物，适合同时保留亲水性及亲脂性化合物，对不同极性、不同酸碱性化合物均有较好的吸附效果。因此，试验选择HLB固相萃取柱对样品进行富集。

2.3 洗脱液的选择

甲醇是分析抗生素时最常用的洗脱液[1，10，12]。以空白加标水样(加标量100 ng·L－1)为研究对象，分别以10 mL甲醇(分两次加入)、5 mL甲醇＋5 mL 含2%(体积分数，下同)甲酸的甲醇溶液、10 mL含1%(体积分数，下同)氨水的甲醇溶液(分两次加入)为洗脱液，考察了上述洗脱液对12种抗生素回收率的影响，结果见图3。

图3 洗脱液对12种抗生素回收率的影响Fig.3 Effect of eluent on recovery of 12 antibiotics

由图3可知：当选用10 mL 含1%氨水的甲醇溶液(分两次加入)时，各目标物的回收率均较低；当选用10 mL 甲醇(分两次加入)或5 mL 甲醇＋5 mL含2%甲酸的甲醇溶液时，各目标物的回收率均大于60%，并且前者的回收率略好于后者的。考虑试验方法操作简易，易于标准化，最终选用10 mL甲醇(分两次加入)为洗脱液。

2.4 水样体积的选择

分析水中低浓度水平抗生素时，除了选用高灵敏度的检测仪器外，还需要在前处理过程中尽可能去除干扰物质的同时合理提高目标物的浓缩倍数。固相萃取柱中的填料随进样体积的增大逐渐达到饱和，从样品溶液开始进入固相萃取柱的填料床层，到样品溶液穿透床层开始流出，所需的溶液体积被称为穿透体积。穿透体积越大，所需的水样量越多，萃取柱对目标物的富集能力越强。以空白加标水样(加标量100 ng·L－1)为研究对象，考察了水样体积为0.5，1.0，1.5 L 时对12 种抗生素回 收率 的影响，结果见表2。

表2 水样体积对12种抗生素回收率的影响Tab.2 Effect of water sample volume on recovery of 12 antibiotics

由表2可知：当水样体积为0.5，1.0 L 时，各目标物的回收率为68.5%～95.6%；当水样体积为1.5 L时，各目标物的回收率普遍降低，并且磺胺类抗生素的回收率降低更明显。考虑到实际废水样品体积过大时，会造成柱子堵塞，试验选择水样体积为0.5 L。

2.5 干扰试验

在去氯自来水(新鲜自来水放置3 d，不含余氯)和新鲜自来水(含余氯)中分别加入适量的抗生素混合标准储备溶液，使各目标物的质量浓度均为100 ng·L－1，考察了余氯对12种抗生素回收率的影响，结果见图4。

图4 余氯对12种抗生素回收率的影响Fig.4 Effect of residual chlorine on recovery of 12 antibiotics

结果显示，对新鲜自来水进行测定时，磺胺类抗生素的回收率较低，而去氯自来水中磺胺类抗生素的回收率明显更高，说明余氯的存在会干扰磺胺类抗生素的测定。

2.6 还原剂的选择

根据文献[15]，通过加入还原性物质可消除水样中余氯的干扰。分别以硫代硫酸钠和抗坏血酸为还原剂，试验考察了上述两种还原剂对新鲜自来水加标样品(加标量100 ng·L－1)中12种抗生素回收率的影响，结果见图5(a)。

结果显示：当以硫代硫酸钠为还原剂时，磺胺类抗生素的回收率比不加还原剂时的显著升高，而喹诺酮类和大环内酯类抗生素的回收率明显降低，说明以硫代硫酸钠为还原剂时，会影响喹诺酮类及大环内酯类抗生素的测定；当以抗坏血酸为还原剂时，12种抗生素的回收率均相对较好。

同时，试验考察了硫代硫酸钠和抗坏血酸对废水加标样品(加标量100 ng·L－1)中12种抗生素回收率的影响，结果见图5(b)。

图5 还原剂对12种抗生素回收率的影响Fig.5 Effect of reducing agent on recovery of 12 antibiotics

结果显示：与新鲜自来水基本一致，不加还原剂时，磺胺类抗生素的回收率较低，这可能是由于废水成分复杂，某些组分干扰磺胺类抗生素的测定；当以硫代硫酸钠为还原剂时，磺胺类抗生素的回收率明显升高，但喹诺酮类抗生素的回收率降低；当以抗坏血酸为还原剂时，12种抗生素的回收率均大于60.0%。

在500 mL 废水样品中分别加入80，100，150 mg抗坏血酸，进一步考察了不同用量的抗坏血酸对12种抗生素回收率的影响。结果表明，抗坏血酸用量对12种抗生素的回收率没有明显影响。考虑到废水成分复杂，为充分消除余氯、过氧化氢等物质的干扰，试验最终选择在500 mL 废水样品中加入150 mg抗坏血酸。

2.7 水样放置时间的选择

用6 mol·L－1盐酸溶液将500 mL废水加标样品(加标量100 ng·L－1)酸度调节至pH2.0，再加入150 mg抗坏血酸和250 mg乙二胺四乙酸二钠，密封，于4 ℃中保存，考察了水样放置时间(1，2，3，7，14 d)对12种抗生素回收率的影响，结果见图6。

图6 水样放置时间对12种抗生素回收率的影响Fig.6 Effect of water sample storage time on recovery of 12 antibiotics

结果显示：随着放置时间的延长，大部分目标物的回收率均呈现逐渐降低的趋势；其中磺胺类抗生素的降低速率较慢，而喹诺酮类与大环内酯类抗生素在7 d后回收率降低明显。综合考虑，水样应在3 d内分析完毕。

2.8 基质效应

在测定过程中，样品中其他物质会干扰目标物的离子化过程，造成离子化抑制或增强，从而产生基质效应(ME)。按照试验方法对废水样品进行处理，配制成质量浓度为0.40μg·L－1的基质匹配的混合标准溶液，以初始比例流动相为稀释溶剂，配制成相同质量浓度的混合标准溶液，按照仪器工作条件进行测定，以各目标物在上述两种溶液中信号强度的比值计算ME 值[16-18]，结果见表3。当ME 值在0.8～1.2内时，表明ME可忽略。

表3 基质效应Tab.3 Matrix effect

结果显示，除SMZ和FLE的ME值略小于0.8以外，其余抗生素的ME 值均在0.8～1.2内，说明该方法基质效应不明显，因此试验采用稀释溶剂配制的混合标准溶液系列绘制标准曲线。

2.9 标准曲线、检出限和测定下限

移取适量的混合标准储备溶液和内标储备溶液，用稀释溶剂逐级稀释，配制成12种抗生素质量浓度为2.00，5.00，10.0，20.0，100，200μg·L－1，内标质量浓度为50.0μg·L－1的混合标准溶液系列。以各抗生素与内标质量浓度的比值为横坐标，以目标物与内标峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，12种抗生素标准曲线的线性范围为2.00～200μg·L－1，线性回归方程及相关系数见表4。

重复7 次空白试验，计算测定值的标准偏差(s)，以3.143倍标准偏差作为检出限(3.143s)，4倍检出限作为测定下限，结果见表4。

表4 线性参数、检出限和测定下限Tab.4 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.10 精密度和回收试验

按照试验方法对500 mL空白水样进行加标回收试验，每个浓度水平制备6份，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表5。

表5 精密度和回收试验结果(n=6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n=6)

2.11 样品分析

按照试验方法对某城市污水处理厂总排口水、某医院污水处理设施出口水、某养殖场地下水、某单位生活污水排口水、某水厂出口水进行分析，结果见表6。在实际样品分析时，对于超出线性范围的样品进行稀释或浓缩。

表6 样品分析结果Tab.6 Analytical results of the samples μg·L-1

结果显示：某城市污水处理厂总排口水中，3类抗生素均被检出，其中OFX 的检出量达139μg·L－1；某单位生活污水排口水、某医院污水处理设施出口水和某水厂出口水中，喹诺酮类和大环内酯类抗生素被检出，但某水厂出口水中的检出量较低；某养殖场地下水中，仅磺胺类抗生素SMM 被检出。由此可见，城市及医院污水中检出的喹诺酮类和大环内酯类抗生素可能与人体服用抗生素药物有关；城市污水处理厂的水源复杂，检出的抗生素种类较多；养殖场地下水只检出磺胺类抗生素，可能与该养殖场使用兽用磺胺类抗生素药物有关，说明抗生素会随动物粪尿排出体外，进入到环境中，进而在环境介质中富集，对人体健康带来潜在风险。

本工作提出了固相萃取-LC-MS/MS同时测定废水中12种抗生素含量的方法，该方法准确度好、精密度高，易于推广应用，为废水中多种抗生素残留量的分析提供了灵敏、可靠的技术手段。利用该方法对5个不同来源的废水样品进行分析，发现大多数污水处理系统不能完全去除废水中的抗生素，由此带来的健康风险需要引起相关部门的重视。