利用多壁碳纳米管的QuEChERS技术结合液相色谱-质谱法测定食用菌农药残留量*

薛科宇，田继锋，宋国华，魏 珂，金子纯，赵婕妤，侯晓慧

（许昌市农产品质量安全检测检验中心许昌市农产品质量安全检测与风险评价重点实验室，河南 许昌 461000）

食用菌营养丰富，富含蛋白质、矿物质、维生素、膳食纤维等营养成分和多糖类、核苷类等功能性成分，是集“天然、营养、保健”为一体的绿色食品，是人类饮食结构的重要组成部分。同时，因栽培成本低、投资小、市场好的特点，近几年食用菌产业得到了快速发展。2020年全国食用菌总产量达4 043.87万吨，总产值达3 127亿元。在我国部分地区，食用菌产业已经成为优势产业和脱贫产业，极大地促进了农村经济发展，增加了农民收入[1-2]。

在食用菌栽培过程中，为有效抵制其竞争性杂菌、防治病虫害、提高出菇产量及品质，会使用一定量的农药。农药的大量使用，虽然有效地防止了病虫害，提高了经济效益，但也给人类的身体健康以及生态环境带来严重的威胁。并且，食用菌的基质来源比蔬菜复杂，因此建立快速、高效、灵敏的食用菌多农药残留检测技术具有十分重要的意义。

目前，农药残留的分析方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等；样品前处理技术主要有固相萃取法、凝胶渗透色谱法、加速溶剂萃取法等[3-7]。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe） 是一种新颖、快速的分散固相萃取技术，具有快速、简单、廉价、有效、可靠、安全的特点，很多研究都是以该方法为基础开展的。碳纳米管因其独特的微观结构和较强的吸附能力，成为近年来研究的热点。基于碳纳米管的固相萃取技术具有操作简单、快速、灵敏度高和重现性好等方面的特点，逐渐应用于食品安全检测领域中[8-12]。

通过利用多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNTs） 的吸附性能，结合QuEChERS法，样品经乙腈提取，液相色谱-质谱分析检测，建立一种高效、快速、准确分析食用菌中多种农药残留的分析方法。结果表明，该方法操作简单、分析准确高效，适用于食用菌的日常检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

农药标准溶液（1 000 μg·mL-1），农业部环境保护科研监测所；QuEChERS提取盐包（柠檬酸缓冲液体系盐包，4 g硫酸镁和1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠），北京绿棉科技有限公司；QuEChERS净化离心管（900 mg硫酸镁），采购自上海安谱科技有限公司；多壁碳纳米管（外径20 nm～30 nm，长度 0.5 μm～ 2.0 μm，纯度＞95%），南京先锋纳米材料科技有限公司；乙腈、甲醇、丙酮（色谱纯），美国Fisher scientific公司；乙酸（分析纯），美国Fisher Scientific公司；乙酸铵（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。试验用水为超纯水。

供试食用菌品种包括金针菇（Flammulina velutipes）、香菇 （Lentinus edodes）、平菇 （Pleurotus ostreatus）、蟹味菇 （Hypsizygus marmoreus），均购自许昌市当地超市。

1.2 仪器与设备

HS20500D型超声波清洗器，天津市恒奥科技发展有限公司；ZG-YM1701型破壁机，宁波赵记电器有限公司；0.22 μm微孔滤膜，天津市津腾实验设备有限公司；TTL-DCII型氮吹仪，北京同泰科技发展有限公司；EVOQ LC-TQ液相色谱质谱联用仪，德国布鲁克公司；ULPHW-IV超纯水仪，四川优普超纯科技有限公司；BS224S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 试验条件

1.3.1 标准储备液配制

分别准确移取每种标准溶液（1 000 μg·mL-1）0.8 mL于5 mL容量瓶中，用丙酮稀释定容，配制成160.00 μg·mL-1的混合标准储备液，转移到棕色瓶中，-20℃保存。

1.3.2 样品前处理

准确称取粉碎后的食用菌样品10.00 g于离心管中，加10.00 mL乙腈，加入提取试剂包，迅速振荡1 min；放入离心机以4 200 r·min-1离心5 min，取上清液6 mL于净化管中；震荡1 min后4 200 r·min-1离心5 min，取上清液4 mL于加有净化剂的15 mL离心管中；40℃水浴氮吹近干，加入4 mL丙酮后超声30 s；经0.22 μm微孔滤膜过滤后放入进样小瓶，待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Acclaim TM RSLC 120 C18（柱长100 mm，直径2.1 mm，粒径2.2 μm）；柱温：30℃；流动相A：水（10 mmol·L-1乙酸铵+0.01%乙酸）；流动相B：甲醇（10 mmol·L-1乙酸铵+0.01%乙酸）；梯度洗脱程序：0～3 min，11.0%～39.9%流动相B，流速 0.20 mL·min-1；3 min～14 min，39.9%～99.9%流动相 B，流速 0.40 mL·min-1；14 min～16 min，99.9%流动相 B，流速 0.40 mL·min-1～ 0.48 mL·min-1；16 min～20 min，99.9%流动相 B，流速 0.48 mL·min-1；20.1 min～23.0 min，冲洗，流动相B由99.9%逐渐减少至 1.0%，流速 0.48 mL·min-1；进样体积 5 μL。

1.3.4 质谱条件

电离源模式：正离子模式。

扫描模式：多反应监测；离子源电压3 500 V，雾化器电压40 V；干燥气流速20 L·min-1，干燥气温度350℃；鞘气电压40 V，鞘气温度400℃。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

理想的液相色谱流动相中有机相应具有粘度低、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。大部分液相分析试验的流动相中有机相多选择甲醇或乙腈[13]，因此设计分别以甲醇和乙腈作为有机相的试验。同时，在液相色谱-质谱分析过程中，信号的强度会因为离子强度的变化而改变。在流动相中添加缓冲盐，可有效地稳定体系，并提高信号响应强度。参照参考文献[14-16]，试验常用的添加剂为挥发性有机酸和低浓度的盐，挥发酸浓度不超过0.1%，盐浓度小于10 mmol·L-1[13]。因此设计分别以水-甲醇（均含有10 mmol·L-1乙酸铵）、水-乙腈（均含有10 mmol·L-1乙酸铵）作为流动相进行试验，对常见农药混标溶液进行质谱分析。结果显示，在2种流动相中，常用农药标准品均有响应；但在甲醇流动相中，农药标准品的响应高于乙腈流动相。同时，试验中还发现部分农药标准品的峰型并不理想，少数出现前拖现象。为了优化峰型，在流动相中加入低浓度的乙酸（含量0.01%）进行试验，结果见图1。

图1 目标化合物色谱图Fig.1 Chromatogram of target compound

如图1所示，流动相中加入低浓度的乙酸（含量0.01%） 使其峰型得到优化，图1中目标化合物的浓度为0.10 mg·L-1。因此，选取水-甲醇（均含有10 mmol·L-1乙酸铵和0.01%乙酸） 作为色谱分析的流动相。

2.2 定性分析

用选定的流动相对目标化合物标准品溶液进行质谱分析。在正离子扫描下，调整碰撞电压，确定目标化合物的定性离子对和定量离子对。各目标化合物峰型完整，各离子对符合定性分析要求[17]，具体结果见表1。

表1 目标化合物保留时间及质谱信息Tab.1 Retention time and MS Spectrometer results of target compound

2.3 线性关系与检出限

将农药混合标准溶液配制成一系列不同含量的标准溶液（0.01 ug·mL-1～0.40 ug·mL-1），在选定条件下进行测定，以样品中各种目标化合物峰面积为纵坐标，质量浓度（ug·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，目标化合物在0.01 ug·mL-1～0.40 ug·mL-1质量浓度范围内线性良好，相关系数r均大于0.99，定量限为0.01 ug·mL-1，可以满足定量分析要求。

2.4 多壁碳纳米管的选择

为了能够选择到比较合适的碳纳米管，选择未检出农药残留、基质干净的平菇空白样品，添加已知浓度（本次试验浓度为0.10 mg·kg-1）农药目标化合物，按照前处理方法进行试验。以碳纳米管作为试验对象，设置5 mg、25 mg、50 mg的用量进行试验。前处理后经LC-MS/MS检测计算获得各目标物加标回收率，结果见图2。

图2 碳纳米管不同用量的目标物回收率Fig.2 Recovery of target compounds with different amounts of carbon nanotubes

由图2可知，目标化合物的回收率与用量不呈现正相关关系。通常情况下，多农残分析方法中各目标物的平均回收率应满足的范围是70%～120%，试验结果显示个别目标物的回收率不能满足检测要求，如乙酰甲胺磷、多菌灵、敌敌畏、亚胺硫磷、特丁硫磷、特丁硫磷亚砜、特丁硫磷砜、嘧霉胺、除虫脲、治螟磷、咪鲜胺等化合物。这可能是因为碳纳米管的用量大，吸附效果增强，造成某些农药目标化合物的吸附，从而回收率降低。综合以上因素，选择5 mg的碳纳米管用量进行后续试验。

2.5 加标回收试验

在粉碎后的金针菇、香菇、平菇空白样品（未检出农药残留、样品基质干净） 中分别加入0.03 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.30 mg·kg-1混合农药标准对照品，每个水平重复测定5次。按照样品前处理方法，经液相色谱-质谱检测，得到目标化合物的回收率范围，结果见表2。

表2 目标化合物添加回收率及相对标准偏差（n=5）Tab.2 Spike recoveries and RSDs of target compounds(n=5)

如表2所示，目标化合物的加标回收率和相对标准偏差均符合检测要求[18-19]。

2.6 样品的测定

对市场上销售的蟹味菇按照前处理方法进行测定，结果未检出有农药残留物。

3 结论

食用菌中含有色素、蛋白质、氨基酸等物质，在检测过程中会干扰目标化合物的响应。通过参考QuEChERS前处理技术，并对其进行改进，用碳纳米管代替传统QuEChERS方法中的PSA（乙二胺-N-丙基硅烷），利用碳纳米管的强吸附性，提升净化效果。对检测条件、前处理条件进行了优化，常见的农药残留在香菇、平菇、金针菇等食用菌样品中均得到了较好的回收率，满足定性分析、定量分析的检测要求。本方法操作简单、结果准确、可行性强，能够快速检测食用菌中常见农药残留，可为食用菌中常用农药残留的风险检测提供技术支持。