“沪农灵芝1号”代料栽培培养基配方优化研究*

陈 群，阚劲松，杜军华，刘仙明

（1.合肥学院生物食品与环境学院，安徽 合肥 230601；2.青海师范大学生命科学学院，青海 西宁 810008；3.东至县葛公菌种场，安徽 池州 247240）

灵芝（Ganoderma lingzhi）隶属于担子菌门（Ba sidiomycota）灵芝科（Ganodermataceae）灵芝属（Ganoderma），被《神农本草经》《本草纲目》等中医名著列为上品之物，在中国传统文化中被视为吉祥之物，素有瑞草的美誉[1]。灵芝子实体、孢子粉、菌丝体均可入药，含有多种生物活性成分，如多糖类、核苷类、多肽类、三萜类等，其中多糖和三萜两大类活性物质被认为是灵芝的主要药效成分[2]。现代药理学研究表明，灵芝可以提高机体免疫能力、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、提高机体耐缺氧能力，以及改善睡眠质量、安心养神等，具有广阔的研究开发前景[3]。

40年来，食（药）用菌科研工作者紧密围绕应用最新分子生物学技术为育种服务，解决生产实践中科学问题等主题开展众多科学活动[4]，促进食用菌种业的健康发展，更好地满足食用菌产业高质量可持续发展的需求[5]。“沪农灵芝1号”是上海市农科院食用菌研究所利用遗传学和现代分子生物学技术培育成功的灵芝品种。其特点为抗病、高产，孢子粉产量高，多糖和三萜含量高。因抗病能力强可较大程度减少农药使用，确保灵芝子实体和孢子粉质量安全[6-7]。

“沪农灵芝1号”在浙江、安徽有较大栽培面积，但均是椴木栽培。椴木栽培消耗木材资源较多，不符合当今农林产业可持续发展理念。因此开发代料栽培模式，减少木材消耗，充分利用木屑、秸秆、甘蔗渣等农林废弃物，可实现废弃物资源化利用，取得社会效益和经济效益良性平衡。

通过对前期文献[8-9]及大量实际生产情况调研，研究选取杂木屑为碳源，麸皮、尿素为氮源，以尿素添加、钙盐添加量、镁盐添加量作为试验因素，优化“沪农灵芝1号”菌丝代料培养基配方，为“沪农灵芝1号”原种、栽培种、代料栽培的培养基配方提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

“沪农灵芝1号”母种为东至县葛公菌种场的商品生产种，在东至县葛公菌种场制作成接种用原种。杂木屑（不含松木）和麸皮由东至县葛公菌种场采购提供，食品级石膏采购自山东昊启生物科技有限公司，食品级一水硫酸镁采购自潍坊圣川化工有限公司。

1.1.2 试剂

葡萄糖、蒽酮、硫酸、甲醇、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯、乙醇均为分析纯，西陇科学股份有限公司产品；香草醛（纯度99%）、齐墩果酸（纯度98%），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

AE124分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；UV7600紫外-可见分光光度计，上海棱光技术有限公司产品；JY92-IIN超声波处理器，宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-8恒温水浴锅，金坛区环宇科学仪器厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 响应面试验优化代料栽培配方

在前期预试验基础上，用于调配代料培养料原料物质有：木屑（1 000 g）、麸皮（200 g）、玉米粉（20 g）、白砂糖（15 g）、石膏（25 g）、尿素、过磷酸钙、硫酸镁，pH自然，根据试验处理组尿素、钙盐、镁盐添加量要求，变动尿素、过磷酸钙、硫酸镁添加量以调整试验组配方。

菌种培养料装袋量为500 g，设计25 mL接种杯固定接种量，接种于菌种袋一端中心位置。20℃～28℃恒温无光培养，空气湿度控制在75%左右，每天上午8:00、下午5:00固定开门窗通风30 min。所有装袋与接种均在一轮试验批次完成。根据前期预试验，结合生产实际，应用Design-Expert软件中Box-Behnken模块（Box-Behnken Design，BBD） 设计3因素3水平因素水平表，共产生17次BBD试验处理组，其中含5次中心点（基准水平）重复试验，每处理组设置10袋重复，具体配方见表1。

表1 响应面试验因素水平表Tab.1 The factor and levels of response surface experiments

记录接种后菌丝长满种瓶天数，取（100-实际天数）为响应值R。应用软件进行多元回归拟合处理，获取二次多项式回归方程，利用方差分析对该模型的显著性进行分析和评价，利用软件优化功能获取最佳参数的预测值。

1.3.2 田间代料栽培试验

在葛公菌种场山地搭建高2.8 m～3.0 m的棚架，棚架四周用遮阳网围住。棚架内再搭建高约2.5 m的拱形栽培大棚，拱棚上覆盖无滴膜，拱棚四周挖排水沟。拱棚下做畦，畦上进行灵芝代料栽培。

栽培前对场地进行清洗消毒，根据生产实际情况和原料成本综合考虑，并参考响应面试验结果制定栽培料配方。菌棒装袋量为1 500 g，设计50 mL接种杯固定接种量，接种于菌种袋一端中心位置，11月底至次年2月制棒接种，4月～6月排场栽培，6月～7月出芝，7月～8月收粉。

在灵芝菌芽开伞前，整畦铺上接粉地膜。当灵芝生长成熟且菌盖边缘完全变成红褐色时，在每畦插上小拱架，架上覆盖无纺布，将整个畦罩住以便进行孢子粉收集。灵芝产粉之前采收部分灵芝子实体。子实体与孢子粉烘干、称重，按2015版《中华人民共和国药典》方法[10]对孢子粉多糖和三萜含量进行测定。

田间试验于2019年和2020年共进行2次，同时每次制备少量椴木埋土栽培菌棒作为对照。

2 结果与分析

2.1 Box-Behnken响应面设计优化栽培料配方

响应面试验优化设计结果见表2。

表2 响应面试验优化设计结果Tab.2 The optimized results of response surface experiments

对建立的二次方程模型和试验结果进行方差分析，检验该模型的有效程度，结果见表3。

表3 BBD试验方差分析表Tab.3 The variance analysis of BBD experiments

由表3可知，该模型的F值较大，为64.7，P＜0.000 1，说明相关系数的显著性，拟合程度较好；失拟F值为3.4，其P＞0.05，说明失拟项不显著，因此模型在被研究的区域内拟合度比较高，因此该模型可以用于后期的优化处理。在一次项中，尿素比例与钙盐比例均达到了极显著水平（P＜0.01），镁盐比例对结果影响不显著（P＞0.05）；在二因素交互项中，尿素比例与钙盐比例、尿素比例与镁盐比例间均存在交互作用（P＜0.01）。从以上分析数据还可以得出，单因素对菌丝长满接种瓶天数影响顺序由大到小为：尿素比例（A） >钙盐比例（B） >镁盐比例（C），交互作用对天数影响顺序由大到小为：AC>AB>BC。

经过Design-Expert 8.0软件进一步对试验数据进行处理，拟合出了关于A、B、C的二次多项回归方程：

R=33.60+4.63A+1.75B+0.12C-2.25AB-2.50AC-0.25BC-11.05A2-5.3B2-2.55C2

方程中的正负符号及系数反映了不同因素对于R的影响方向及程度。通过SPSS最优化处理，得出当尿素比例（A） 为0.9%、钙盐比例 (B)为2.55%、镁盐比例 (C)为0.08%时，菌丝长满接种瓶的时间为66.4 d。

以本响应面试验优化出的参数，结合生产实际，结合菌丝形态学特征，设计原种、栽培种培养基配方。

2.2 田间代料栽培试验

根据生产实际情况和原料成本综合考虑，并参考响应面试验结果制定2019年田间代料栽培培养料配方（木屑15 000 kg、豆粕100 kg、麦麸1 000 kg、石膏150 kg、石灰200 kg、硫酸镁10 kg），装袋量为1.5 kg，尿素比例1.4%，钙盐比例2.1%，镁盐比例0.6%。其代料栽培与椴木栽培的子实体与孢子粉的多糖和三萜含量见表4。

表4 2019年田间代料栽培配方子实体与孢子粉多糖、三萜含量测定结果（n=10）Tab.4 The determination results of polysaccharides and triterpenes in fruit body and spore powder of culture media for field substitute cultivation in 2019(n=10)

由表4可知，2019年代料栽培子实体与孢子粉三萜含量均低于椴木栽培，差异显著，2种栽培模式下，多糖、三萜含量均远高于药典标准水平。另外还可发现，无论是代料栽培还是椴木栽培，孢子粉三萜含量均高于子实体，而多糖含量则均低于子实体。因此2020年调整栽培料配方，降低尿素添加至0.84%，钙盐、镁盐添加比例不变，适当添加葡萄糖与磷肥，其配方调整为木屑15 000 kg、豆粕300 kg、麦麸1 500 kg、石膏150 kg、石灰200 kg、硫酸镁10 kg、葡萄糖100 kg、磷肥50 kg，其代料栽培与椴木栽培的子实体与孢子粉的多糖和三萜含量见表5。

表5 2020年田间代料栽培配方子实体与孢子粉多糖、三萜含量测定结果（n=10）Tab.5 The determination results of polysaccharides and triterpenes in fruit body and spore powder of culture media for field substitute cultivation in 2020(n=10)

由表5可知，通过上述配方调整，三萜含量有所提高，达到椴木栽培的三萜含量水平。2019年、2020年2年田间试验产量结果表明，2种栽培模式下，代料子实体与孢子粉产量均高于椴木栽培，代料栽培孢子粉平均棒产35.6 g，产粉后子实体35.2 g，产粉率101%。代料子实体与孢子粉产量均较高，发展代料灵芝栽培，不仅生产宝贵中药材，还是回收利用碎木屑、蔗渣、秸秆等农林废弃物的有效途径，生态环境效益显著。

3 结论

随着社会进步和生活水平提高，人们养生健体、治未病的理念越来越强，消费需求也越来越多。灵芝产业健康发展，可满足人们高水平生活的需要，社会意义重大。开发“沪农灵芝1号”代料规范化标准栽培模式，完善配套灵芝产业链和产业技术服务体系，引导合作社与农户组织代料栽培。充分利用农林废弃物资源，实现废弃物资源化利用，减少木材消耗，引领灵芝产业的升级转型和可持续发展。有助于灵芝产业实现专业化分工、集约化布局、产业化经营的新格局。此举不仅保护环境，还可带动合作社、菇农增产增收、农村劳动力就业，实现经济效益和环境效益双丰收，进而促进政府乡村振兴工作，助力美丽乡村建设。