参地颗粒对C-BSA大鼠内质网应激及足细胞损伤的干预作用*

韩佳月，项建军，金华

1 安徽中医药大学研究生院 安徽合肥 230000 2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230000

膜性肾病（Membranous nephropathy，MN）是一组由免疫复合物介导的足细胞病变，临床表现为大量蛋白尿，为肾病综合征最常见的病理类型之一[1]。MN传统治疗为激素联合免疫抑制剂，但部分患者出现感染、股骨头坏死等副作用[2]，且病情易反复，最终进展至终末期肾病（ESRD），对患者生活质量造成严重影响。近年来发现[3-4]，持续的内质网应激（ERS）是足细胞损伤的重要因素，而自噬对内质网应激介导的足细胞损伤具有保护作用，该机制有望成为防治足细胞病变的重要途径。大鼠尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）是制作MN的经典模型。中医药治疗MN体现出一定的优势，既往研究证实参地颗粒在治疗肾小球疾病中已取得显著疗效[5-6]。本研究将进一步观察参地颗粒对C-BSA大鼠肾脏内质网应激及足细胞损伤的干预作用，从而探讨其治疗MN的作用机理。

材料与方法

1 实验动物

2月龄清洁级雄性SD大鼠40只，体质量（200±20）g，购自安徽医科大学实验动物中心（合格证号：SCXK（鲁）2019-0003），适应性喂养1周。

2 实验药物与试剂

参地颗粒（人参、熟地黄、茯苓、五味子、桑螵蛸、鸡内金、川芎），由安徽省中医院制剂中心研制（皖药制字BZ20080025），每袋颗粒剂10g，含生药剂量 34 g。缬沙坦胶囊（北京诺华制药有限公司），国药准字：H20040217，每片80mg。阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）购自北京索莱宝科技有限公司（批号：725M036）。弗氏不完全佐剂（F5506）购自Sigma公司（批号SLBL9742V）。尿蛋白浓度测定试剂盒，购自南京建成公司（批号：20201204）。

3 模型建立及分组

采用单纯随机抽样法将40只大鼠随机分为正常组、模型组、参地颗粒组、缬沙坦组4组，每组各10只。除正常组外，其余30只大鼠均采用大鼠尾静脉注射C-BSA建立MN模型[7]：预免疫：取C-BSA 100mg溶解于生理盐水15mL中与等量不完全弗氏佐剂混合，充分乳化。取混合液1ml分别在 40 只大鼠双侧腋下、腹股沟作多点皮下注射，隔日1次，共3次。正式免疫：将C-BSA按照16mg·kg-1·d-1尾静脉注射，每周3次，连续4周。用代谢笼中收集24h尿液进行尿蛋白检测，按24h尿蛋白量≥20mg视为建模成功，＜20mg者剔除。正常组大鼠以相同的注射方式注射等体积生理盐水。

4 给药方法

造模成功后开始灌胃，正常组、模型组均给予10ml/kg·d 0.9%的氯化钠注射液灌胃；参地颗粒组给予参地颗粒水溶液按4.0g/kg·d灌胃；缬沙坦组将缬沙坦胶囊混悬液按20mg/kg·d灌胃。3ml/次，1次/d，连续给药8周。

5 标本采集及检测方法

给药8周后代谢笼收集大鼠24h尿液，用比色法测定尿蛋白浓度（24h尿蛋白量＝尿蛋白浓度×24h尿量）。2%的戊巴比妥麻醉大鼠，摘取右侧肾脏放入冻存管内，投放到液氮中，再转入-80℃超低温冰箱保存，以备Western blot检测。

Western blot检测方法：取100mg肾组织加入1ml组织裂解液（RIPA）及蛋白酶抑制剂制备组织匀浆，10000r/min离心40min，收集上清液，提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白含量。100℃变性10min，每组取等量蛋白质经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后，电转移到PVDF膜上。10%脱脂奶粉-TBST溶液室温封闭4h后，置入加有一抗的10%奶粉-TBST，4℃冰箱孵育过夜（一抗稀释比例GRP78、CHOP为1:500；Nephrin、Podocalyxin为1:1000；β-actin为1:1000）；次日用TBST漂洗后加入HRP标记的二抗（稀释比例为1:1000），室温孵育2h；TBST漂洗，加入ECL后曝光；用Fluors凝胶成像系统分析蛋白条带，蛋白的相对含量以目的蛋白吸光密度×面积与β-actin条带的比值表示。

6 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计分析，结果用均值±标准差来表示，两组间比较采用t检验；若资料不符合正态分布或方差不齐则采用非参数检验；P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠24hUpro比较

模型组大鼠的24hUpro显著高于正常组（P＜0.05）。与模型组比较，参地颗粒组和缬沙坦组大鼠的24hUpro显著降低（P＜0.05）；且参地颗粒组大鼠的24hUpro变化显著优于缬沙坦组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠24hUpro比较（ ±s）

表1 各组大鼠24hUpro比较（ ±s）

注：模型组与正常组比较：*P＜0.05；各治疗组与模型组比较：▲P＜0.05；参地颗粒组与缬沙坦组比较：△P＜0.05。

组 别 例数 24hUpro/mg·24h-1正常组 8 5.62±1.55模型组 6 33.54±4.85*参地颗粒组 7 22.65±6.20▲△缬沙坦组 6 26.38±5.03▲

2 各组大鼠肾脏中GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin蛋白表达比较

与正常组比较，模型组大鼠肾组织中的GRP78、CHOP、Beclin1蛋白相对表达量均显著增加，而Nephrin、Podocalyxin蛋白相对表达量显著减少（P＜0.05）。与模型组比较，参地颗粒组和缬沙坦组大鼠肾组织中的GRP78、CHOP表达量均显著减少，而Nephrin和Podocalyxin表达量则显著升高（P＜0.05）；且参地颗粒组GRP78、CHOP、Podocalyxin的表达变化均显著优于缬沙坦组（P＜0.05）。见图1，表2。

图1 各组大鼠肾脏GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表达比较

表2 各组大鼠肾脏GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin相对表达量比较（±s）

表2 各组大鼠肾脏GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin相对表达量比较（±s）

注：模型组与正常组比较：*P＜0.05；各治疗组与模型组比较：▲P＜0.05；参地颗粒组与缬沙坦组比较：△P＜0.05。

组别 例数 GRP78 CHOP Nephrin Podocalyxin正常组 8 0.45±0.03 0.41±0.02 0.63±0.05 0.68±0.02模型组 6 0.90±0.04* 0.92±0.07* 0.29±0.04* 0.27±0.03*参地颗粒组 7 0.66±0.03▲△ 0.61±0.03▲△ 0.44±0.02▲ 0.55±0.03▲△缬沙坦组 6 0.78±0.01▲ 0.74±0.03▲ 0.40±0.03▲ 0.39±0.04▲

讨 论

MN的发病主要是由于抗原-抗体免疫复合物沉积在肾小球毛细血管袢，导致基底膜弥漫性增厚。但是近年来研究发现，足细胞病变也参与到MN的核心发病机制中[8]。由于足细胞缺乏再生能力，因此足细胞的损伤是导致肾小球疾病进展直至走向ESRD的主要原因。内质网是一种维持细胞内环境稳定的细胞器，在缺血、缺氧、氧化应激等应激状态下，内质网环境被破坏，从而导致未折叠蛋白的积累，称为内质网应激（ERS）[9]。足细胞含有丰富的内质网系统，ERS是MN重要的发生机制之一，适度的 ERS 是细胞应对外界刺激的保护机制，但发生在肾组织内持续或过强的应激反应是诱导足细胞损伤的机制之一[10]。足细胞损伤后导致肾小球滤过屏障受损，进而导致持续蛋白尿的生成。GRP78、CHOP是内质网应激的关键因子，GRP78是一种位于内质网中的葡萄糖调节蛋白，参与蛋白质在内质网中的糖基化修饰，在发生内质网应激时明显增多，故可作为内质网应激的标志性蛋白[11]，其表达水平反映了细胞应激的严重程度。CHOP 是 ERS信号通路下游重要的促凋亡因子，在内质网应激诱导的细胞凋亡和细胞损伤中具有重要作用，是内质网应激诱导多种细胞产生调亡的关键信号分子[12]。ERS诱导细胞凋亡通路在严重ERS时都可以增加CHOP基因的表达。本研究发现，作为MN的经典动物模型，C-BSA大鼠肾组织中GRP78、CHOP表达上调，而足细胞标志蛋白Nephrin、Podocalyxin表达减少，提示C-BSA大鼠出现ERS反应增强及足细胞损伤。

近年来研究发现，中医药在调节免疫功能、减少免疫抑制剂所带来的代谢紊乱和免疫力下降等方面有独特的作用。膜性肾病（MN）是慢性肾炎的主要病理类型，其基本病机是脾肾亏虚、精微下注[13]。参地颗粒是根据清朝新安医学名家程林所著《圣济总录纂要·卷十三·虚劳门》中的人参汤化裁而成，功效为健脾益肾、固摄精微，前期研究显示该方能够通过降低炎症因子释放和抑制炎症反应，具有改善慢性肾炎患者的临床症状，减轻蛋白尿等作用[14]。且近期研究已证实其对慢性肾炎患者和模型大鼠的免疫功能紊乱具有一定调节作用[15]。本研究进一步发现，中药参地颗粒具有减轻C-BSA大鼠的足细胞损伤及蛋白尿作用；并且能够抑制过度的内质网应激反应，进而发挥对足细胞的保护性作用。但是对于ERS在足细胞损伤中的具体机制过程，以及参地颗粒对上述机制的干预靶点等有关研究，仍有待于我们进一步深入探讨。