基于网络药理学解析紫花牡荆素治疗结直肠癌的分子机制*

张靖宜，董思进，王梦琦，杨高明，王 丹，华 丽，周燕红

(湖北科技学院医学部，湖北 咸宁 437100)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，由于不良环境和生活习惯等高危因素影响，其发病率和死亡率每年仍在快速上升[1]，给人民生命和健康带来严重威胁。CRC起病隐匿，早期临床症状不明显，多数癌症患者确诊时已届中晚期，手术和药物治疗临床疗效欠佳[2]，且副作用也较大，因此，为提高结直肠癌晚期患者生活质量，寻找疗效好且副作用小的活性药物分子或者有效部位刻不容缓。

紫花牡荆素(casticin)是从蔓荆子中分离出的一种有细胞毒性的黄酮类成分。目前研究表明，紫花牡荆素有抗炎[3]、抗氧化[4]和抗肿瘤作用[5]，还具有阻滞细胞周期G2/M及诱导癌细胞凋亡作用[6]。而紫花牡荆素诱导K562细胞凋亡的分子机制也被研究[7]发现。已有实验结果[8]揭示紫花牡荆素诱发结肠癌细胞凋亡作用与上调死亡受体-5(DR5)和表达抑制和因子kappaB(NF-κB)活性有关。网络药理学与中医药研究相结合，科学地阐明“药物-靶点-疾病”关系，有助于中药的系统研发[9]。

本研究通过网络药理学分析紫花牡荆素治疗结直肠癌的潜在分子机制，为紫花牡荆素在结直肠癌中的临床应用提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 紫花牡荆素相关作用靶点筛选

以“Casticin”为关键词，通过筛选Pubchem数据(https://pubchem.ncbi.nlm.nIh.gov/)得到紫花牡荆素的2D结构，如图1。将紫花牡荆素的2D结构导入SwissTarget Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction．ch/)[10]获取其相关潜在作用靶点。

1.2 筛选结直肠癌疾病靶点

以“colorectal cancer”为关键词，在OMIM疾病数据库(http://omim.org/)中筛选与结直肠癌相关靶点。运用结直肠癌靶点和紫花牡荆素预测靶点在Venny数据库(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图，得到紫花牡荆素在结直肠癌中的共同靶点。

1.3 药物-作用靶点蛋白相互作用网络的构建

运用 STRING数据库(https://string-db.org/)[11]构建药物-疾病共同靶点蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络图，将紫花牡荆素治疗结直肠癌靶点导入STRING数据库，设置物种为“Homo sapiens(人类)”，最低相互作用阈值设置为“medium confidence(0.400)”，其余参数均为默认设置值。靶点的度值(degree)表示相互作用靶点的个数[12]，以大于中位数的Degree值为关键靶点。

1.4 GO富集与KEGG通路分析

运用DAVID数据库(https://david．ncifcrf．gov/)[13]和KEGG网站(https://www.genome.jp/kegg)对药物-疾病共同靶基因进行GO富集与KEGG通路分析。设置阈值为P<0.05，按P-value升序进行排序，筛选出紫花牡荆素-结直肠癌靶点主要的生物功能及药理作用机制中可能性较大的通路，利用KEGG网站绘制相关通路图。利用微生信在线网站(http://www．bioinformatics．com．cn/)绘制KEGG气泡图及GO富集分析条形图。

1.5 紫花牡荆素-共同靶点-通路网络图构建

将KEGG筛选出的紫花牡荆素与结直肠癌共同作用靶点在结直肠癌相关的作用通路上标注出来，再用cytoscape 软件绘制主要的通路图，验证其多靶点、多途径协同作用于结直肠癌的分子机制。

1.6 紫花牡荆素与靶蛋白分子对接

从RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)和PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载蛋白结构为“PDB”格式和紫花牡荆素2D结构保存为“SDF”格式，然后使用openbabel软件将紫花牡荆素“SDF”格式转化为“PDB”格式，使用Pymol软件去除溶剂分子与配体，使用AutoDock Vina软件[14]进行加氢、加电子、加ROOT等操作，最后用AutoDock vina1.1.2软件Local Search Parameters算法进行分子对接，选择其中结合能最小的对接模型，最后使用Pymol软件绘制靶点蛋白受体和紫花牡荆素之间的结合模式图。

2 结 果

2.1 紫花牡荆素潜在作用靶点筛选

通过pubchem数据库得到紫花牡荆素2D结构见图1，SwissTargetPrediction数据库得到紫花牡荆素相关潜在作用靶点100个。

图1 紫花牡荆素2D结构

2.2 紫花牡荆素与结直肠癌疾病共同靶点筛选

通过OMIM疾病数据库合并去重后得到200个结直肠癌疾病靶点。将紫花牡荆素药物靶点与结直肠癌疾病靶点取交集，最终得到6个共同靶点分别为NQO2、EGFR、ALDH2、AKT1、MPO、SRC绘制韦恩图，如图2、3所示。

图2 紫花牡荆素-结直肠癌共同靶点韦恩图

2.3 共同靶点蛋白质互作网络

通过STRING数据库构建得到6个共同靶点蛋白质互作网络图，如图3。节点之间的连线表示两个蛋白之间的相互作用，不同颜色对应不同的相互作用类型，红色代表基因融合，绿色代表基因邻接，也就是说这两个基因靠得很近，可能具有蛋白相互作用的关系。图中每个节点表示一个蛋白，由于真核生物的可变剪切和转录后修饰，一个蛋白编码基因可能会产生多个蛋白，这将由同一个基因产生的不同isoform进行合并，在节点上标记的字母实际为对应基因的gene symbol。图中有些节点内部有螺旋状的结构，这表示该蛋白的三维结构已知，如果未知，节点内部为空。通过Cytoscape 3.8.2插件(network analyze)计算该网络各靶点连接度，得中位数为3，选取连接度≥3，得到两个关键靶点，分别是络氨酸蛋白激酶(tyrosine-protein kinase SRC,SRC)和丝氨酸蛋白激酶(serinelthreonine-protein kinase AKT，ATK1)。

图3 紫花牡荆素-结直肠癌共同靶点PPI图

2.4 GO富集与KEGG通路分析

6个共同靶点GO富集后得到35个生物过程(biology process，BP)、2个细胞组分(cellular component，CC)、8个分子功能(molecular function，MF)，其中将生物过程取前10个条目制图，见图4。GO富集结果显示共同靶点主要与ERBB2信号通路(ERBB2 signaling pathway)、凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、氧化应激反应(response to oxidative stress)等生物学过程(BP)，与一氧化氮合酶调节活性(nitric-oxide synthase regulator activity)、酶结合(enzyme binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)等分子功能(MF)过程，以及细胞外泌体(extracellular exosome)、线粒体(mitochondrion)等细胞组成(CC)过程密切相关。KEGG 分析后发现6个共同靶点主要富集在 28个通路中， 取前20个通路绘制图，如图5。结果表明，这些共同靶点主要富集在ErbB signaling pathway、Estrogen signaling pathway、Proteoglycans in cancer、Focal adhesion、Rap1 signaling pathway、Bladder cancer、Endometrial cancer、Non-small cell lung cancer、VEGF signaling pathway、Central carbon metabolism in cancer等通路中。其中ErbB通路程度最大，根据共同靶点在KEGG数据库获取ErbB信号通路图，如图6所示。

图4 GO富集分析

图5 KEGG气泡图

图6 ERBB信号通路图(红色代表紫花牡荆素—结直肠癌共同靶点)

2.5 构建紫花牡荆素治疗结直肠癌相关通路网络图

将紫花牡荆素与结直肠癌共同靶点和通路构建网络图，如图7。该网络图包含紫花牡荆素、6个共同靶点、前 20 个 KEGG 信号通路。

图7 紫花牡荆素—共同靶点—通路网络图(黄色：紫花牡荆素；紫色：共同靶点；红色：相关KEGG通路)

2.6 紫花牡荆素与关键靶蛋白SRC与AKT1的分子对接

构建紫花牡荆素与关键靶点 SRC 分子和AKT1分子对接模型，计算对接后-CDOCKERENERGY 值。绿色的条带是蛋白质分子SRC，紫色的棍状结构是配体分子紫花牡荆素，黄色的虚线是它们之间连接的氢键，黑色标签是与配体分子对接的氨基酸残基。结果发现紫花牡荆素与 SRC 分子分子对接模型结合能为-5.64kj/mol(图8)，与AKT1分子对接模型结合能为-8.21kj/mol(图9),结合能均小于0，这表明配体分子(紫花牡荆素)能和受体蛋白(SRC和AKT1)自发地结合。通常与受体结合能越低结合的构象越稳定。结合能小于-4.25kcal/mol提示配体与受体有一定的结合活性,小于-5.0kcal/mol有较好的结合活性，小于-7.0kcal/mol有强烈的结合活性[15]。结果提示紫花牡荆素与潜在关键靶点SRC和AKT1具有较好的结合活性。

图8 紫花牡荆素与关键靶点SRC分子对接构象图 图9 紫花牡荆素与关键靶点AKT1分子对接构象图

3 讨 论

现有研究表明紫花牡荆素抑制包括乳腺癌[16]、肺癌[17]、结肠癌[18]在内的多种癌细胞的生长。紫花牡荆素具有抑制人结肠癌SW480细胞增殖和诱导凋亡的作用，其诱发结肠癌细胞凋亡作用与上调死亡受体-5(DR5)表达和抑制核因子kappaB(NF-kB)活性有关[19]。由此可见，紫花牡荆素在治疗结直肠癌中发挥着重要作用。我们的研究结果发现了6个紫花牡荆素治疗结直肠癌潜在作用靶点，为紫花牡荆素的作用机制也提供了很大的可能性。

从共同靶点的PPI网络图表明紫花牡荆素可能通过这些靶点多途径的协调，对结直肠癌产生治疗作用。在GO功能和通路富集分析中，我们发现紫花牡荆素主要与ERBB2信号通路、凋亡过程的负调控、一氧化氮合酶调节活性、细胞外泌体等密切相关；相关信号通路主要富集在ErbB signaling pathway、Estrogen signaling pathway、Proteoglycans in cancer上。本研究结果可以证实紫花牡荆素通过调控ErbB信号通路，调控SRC和AKT靶蛋白的表达抑制结直肠癌细胞的增殖。通过关键靶蛋白SRC、AKT1进行结合能预测，结果显示紫花牡荆素能与SRC和AKT1自发结合，并形成较为稳定的构象，这与网络药理学的分析结果相吻合。有研究证实SRC可以通过抑制多种促细胞凋亡因子的活性表达，从而抑制细胞凋亡[20]；也有研究表明通过抑制AKT1的表达可以抑制胃癌细胞的迁移及侵袭[21]。由此可得出结论，紫花牡荆素可靶向SRC和AKT1调控ErbB信号通路抑制结直肠细胞的增殖。

本研究通过网络药理学的手段揭示了紫花牡荆素作用于结直肠癌的潜在作用靶点，为中药治疗结直肠的机制提供了新思路。但本研究尚未考虑药物剂量及有效成分提取方法对治疗结直肠癌的影响，因此，本课题组将进一步通过药理实验为紫花牡荆素治疗结直肠癌及后期药物的开发提供实验依据。