糖酵解相关基因与肝细胞癌患者预后关系的研究

(青岛大学附属医院肝胆胰外科，山东 青岛 266003)

肝癌是世界上最常见的原发性恶性肿瘤之一。根据全球癌症统计的数据，肝癌是癌症死亡的第4大原因[1-3]。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌，与慢性肝病关系密切，HBV感染、HCV感染、酗酒和非酒精性脂肪肝等疾病是主要诱因[4]。

糖类是为机体提供生命活动所需能量的主要物质，肿瘤细胞生长代谢的主要能量也来源于糖的代谢,葡萄糖在体内发生氧化分解的两条主要途径是氧化磷酸化和糖酵解。研究显示糖酵解能影响肿瘤细胞的生物学行为[5]。细胞通过胞膜上的葡萄糖转运体(GLUT)将葡萄糖转运入细胞内，生成丙酮酸，这一过程称为糖酵解。丙酮酸在缺氧条件下转化成乳酸，而在有氧条件下经线粒体氧化磷酸化代谢后产生能量。肿瘤细胞活性状态与其所获得的能量紧密相关[6]。肿瘤细胞的能量供给与正常细胞不同，即使在氧含量充足的情况下也会优先通过糖酵解途径消耗更多的葡萄糖产生能量，满足自身的需要，这种现象称为“Warburg effect”或“有氧糖酵解”[7-8]。

本研究首先通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库筛选出HCC组织与正常组织中差异表达的基因，构建HCC中糖酵解相关基因的预后模型；探讨糖酵解相关基因与HCC患者生存率的关系；通过在线数据库cBioPortal分析预后模型中基因的突变位点；并通过单因素和多因素分析探讨影响HCC预后的独立因素。

1 材料及方法

1.1 数据下载与处理

在TCGA数据库[9](包含有50例正常组织样本和374例肿瘤组织样本及377例患者的临床特征数据)检索并下载HCC的RNA表达数据和临床特征信息，利用软件Strawberry Perl 5.32.0[10]将基因表达数据整理成为表达矩阵用于后续分析。

1.2 基因富集分析

从GSEA(www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)网站的MSigDB(Molecular Signatures Database)数据库[11]中获得REACTOME_GLYCOLYSIS.gmt基因集作为参照基因集，利用基因富集分析(4.1.0版本)软件分析正常组织与肿瘤组织的基因与糖酵解途径的富集程度，按照基因富集分析软件默认参数，随机组合1 000次进行富集分析。按矫正后的P值(FDR)进行排序，并将FDR<0.05的基因集作为显著富集基因集，也就是糖酵解相关基因集。

1.3 构建糖酵解相关基因的预后模型并进行生存分析

使用软件Strawberry Perl 5.32.0提取糖酵解相关基因的表达量，构建表达矩阵，进行正常组织和肿瘤组织的差异分析，获得差异表达的糖酵解相关基因；对表达矩阵进行单因素和多因素Cox回归分析，构建预后模型，获得与HCC患者预后密切相关的糖酵解相关基因，为预后相关糖酵解基因。使用R4.0.2软件对预后相关糖酵解基因及377例HCC患者的临床特征进行生存分析，并依据基因风险评分将患者分为高风险组、低风险组，绘制ROC曲线，获取曲线下面积(AUC)。

1.4 糖酵解相关基因预后分析

使用R4.0.2绘制预后相关糖酵解基因的表达热图以及风险评分与患者生存时间的模式图，并进行单因素和多因素的独立预后分析。使用R语言在TCGA数据库中对预后相关糖酵解基因进行差异表达分析；绘制预后相关糖酵解基因与肿瘤临床分级的生存曲线。根据患者年龄及肿瘤分级、分期进行分层分析，将患者分为不同类别的亚组，绘制预后相关糖酵解基因与不同亚组的生存曲线。使用在线数据库cBioPortal(www.cbioportal.org)[12]分析预后相关糖酵解基因的突变类型以及突变率。

1.5 组织标本的获取以及预后相关糖酵解基因的检测

收集青岛大学附属医院肝胆胰外科行肝癌部分肝切除术的30例HCC患者的肿瘤组织及癌旁正常组织标本，使用RNAiso plus试剂盒(日本TaKaRa公司)提取两种组织标本中的总RNA以后，采用PrimeScript TM RT Reagent Kit(日本TaKaRa公司)将总RNA逆转录成互补DNA(cDNA)。后在LightCycler 480上使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，中国)进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测预后相关糖酵解基因的相对表达量，使用软件graphpad 8.0 进行组间比较的t检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 正常样本和肿瘤样本的基因富集分析

将TCGA数据库中下载的424例样本的RNA表达数据和MSigDB数据库中获得的糖酵解相关基因集作为原始数据进行基因富集分析显示，正常组织与肿瘤组织的基因均与糖酵解途径密切相关。

2.2 筛选HCC中糖酵解相关基因并构建预后模型

使用软件Strawberry Perl 5.32.0分析筛选出正常组织和肿瘤组织中差异表达糖酵解相关基因42个，进行单因素及多因素Cox回归分析，构建预后模型，显示B3GAT3、NDC1、KIF20A3个基因与HCC预后密切相关，为预后相关糖酵解基因。

2.3 糖酵解相关基因验证与HCC预后分析

通过R4.0.2软件结合患者的临床特征对高风险和低风险组患者进行生存分析显示，低风险组患者的总体生存时间显著长于高风险组(P<0.001)，绘制的ROC曲线的AUC值为0.691。对预后相关糖酵解基因绘制表达热图显示，B3GAT3、NDC1、KIF20A随着基因风险评分增大，基因表达随之增高；同时随着基因风险评分升高，患者的生存时间显著缩短。单因素以及多因素的独立预后分析显示，患者的肿瘤分期(HR=1.68，95%CI=1.37～2.06,P<0.05)、风险评分(HR=1.10，95%CI=1.06～1.13,P<0.05)是影响患者预后的独立危险因素。见图1A、B。

A：预后相关糖酵解基因的单因素独立预后分析，B：预后相关糖酵解基因的多因素独立预后分析

图1 预后相关糖酵解基因的独立预后分析

Fig.1Independentprognosticanalysisofprognosis-relatedglycolyticgenes

2.4 患者的临床特征和预后相关糖酵解基因的分层分析

使用R语言比较B3GAT3、NDC1、KIF20A在TCGA数据库中正常组织和肿瘤组织中的表达差异情况，结果示3个基因在肿瘤组织中的表达均显著上调(P<0.05)。通过生存曲线对B3GAT3、NDC1、KIF20A与临床特征的相关性进行分析，发现高表达B3GAT3、NDC1、KIF20A的HCC患者肿瘤分期较差(图2A)。根据患者的年龄、分级、分期进行分层分析，将患者分为不同类别的亚组，即年龄>60岁亚组和年龄≤60岁亚组，G1和G2级亚组、G3和G4级亚组、T1和T2亚组、T3和T4亚组，Ⅰ期和Ⅱ期亚组，Ⅲ期和Ⅳ期亚组，绘制糖酵解相关基因与不同亚组的生存曲线显示，在不同类别的亚组当中，低风险组患者的生存期明显长于高风险组患者(图2B～I)。

2.5 B3GAT3、NDC1及KIF20A突变的相关性研究

基于cBioPortal数据库对3个基因在HCC组织中的突变情况进行分析，结果显示，3个基因均可发生突变，其中B3GAT3发生扩增、深度缺失和错义突变的突变率为1.1%，NDC1发生扩增和错义突变的突变率为0.6%，KIF20A发生扩增和错义突变的突变率为0.8%。

2.6 组织标本中基因的检测结果

对我院30例HCC患者的肿瘤组织及癌旁正常组织标本进行RT-qPCR检测，结果显示与癌旁正常组织相比较，HCC组织中B3GAT3、NDC1、KIF20A均显著高表达(t=2.156～2.696)。详见表1。与对TCGA数据库中信息进行分析所获得的结果一致。

表1 组织标本中预后相关糖酵解基因的差异表达Tab.1 Differential expression of prognosis-related glycolytic genes in tissue specimens

3 讨 论

HCC是最常见的消化道恶性肿瘤之一，占全球恶性肿瘤发病率的第6位，其死亡率居第4位。虽然手术切除、放射治疗、化疗和肝移植等治疗方法日益完善[13-14]。但是，由于HCC不易早期发现、术后5年复发率高，患者预后均较差[15]。因此发现HCC潜在的诊断和预后标志物至关重要[16]。

正常情况下，糖酵解是机体缺氧时获得能量供应的主要途径。在肿瘤细胞中会出现与正常细胞不同的代谢变化。有研究认为，肿瘤细胞的糖酵解增加，是肿瘤细胞恶变最基本的变化之一[17-18]。恶性肿瘤的代谢以Warburg效应为特征，即肿瘤细胞的代谢由线粒体的氧化磷酸化向糖酵解转变[19]。虽然有氧糖酵解产生ATP的效率不如氧化磷酸化，但有氧糖酵解可增加还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的合成和氧化防御，与肿瘤细胞的生长以及生存密切相关[20-21]。肿瘤和糖酵解的相关性已成为当前的研究热点，但目前对糖酵解相关肿瘤生物标志物的研究较少[22]。因此该领域成为当前的研究热点，而且糖酵解相关生物标志物也不断被发现并研究[23]。

A：预后相关糖酵解基因与肿瘤分期的生存分析，B：预后相关糖酵解基因在年龄>60岁亚组的生存分析，C：预后相关糖酵解基因在年龄≤60岁亚组的生存分析，D～I：预后相关糖酵解基因在G1和G2级亚组、G3和G4级亚组、T1和T2亚组、T3和T4亚组、Ⅰ期和Ⅱ期亚组、Ⅲ期和Ⅳ期亚组的生存分析图2 临床特征和预后相关糖酵解基因的预后分层分析Fig.2 Prognostic stratification analysis of glycolytic genes associated with clinical features and prognosis

以往研究表明，糖酵解相关基因UCP2能促进胰腺癌细胞的增殖，影响胰腺癌的发生发展，可作为胰腺癌诊断的潜在生物标志物[24],但在HCC中糖酵解相关肿瘤标志物的研究尚不充足。为了研究HCC中预后相关糖酵解基因，本研究通过生物信息学分析的方法，首先筛选出糖酵解相关基因，构建了预后模型，获得预后相关的糖酵解基因(B3GAT3、NDC1、KIF20A)，对预后相关糖酵解基因进行基因风险评分及生存分析发现，随着基因风险评分的增大，患者的生存时间缩短，生存率降低，因此提示B3GAT3、NDC1、KIF20A可能是与HCC患者预后密切相关的潜在生物标志物。

B3GAT3是葡萄糖醛酸转移酶基因家族的一员，该基因产物通过葡萄糖醛基转移反应催化糖胺聚糖-蛋白质连接的形成[25]。有研究检测透明细胞癌组织中B3GAT3的表达水平，结果发现与对照组相比B3GAT3在透明细胞癌中呈现出显著高表达，生存分析发现高表达B3GAT3患者的平均生存期明显低于低表达患者，B3GAT3被认为是透明细胞癌的预后评价指标[26]。NDC1是跨膜核孔蛋白的编码基因。其可在细胞周期、有丝分裂和成熟mRNA的运输中发挥作用[27]。以往研究显示，NDC1在肿瘤组织的表达显著上调，如食管鳞癌组织、肺癌组织等，并且高表达的NDC1与食管鳞癌、肺癌患者的不良预后显著相关[28-29]。KIF20A可与三磷酸鸟苷(GTP)结合形式的RAB6A和RAB6B发生相互作用。可作为RAB6调节高尔基膜和相关囊泡沿微管运输所需的马达。其可在包括细胞周期、有丝分裂和信号转导等功能中发挥作用[30]。既往研究显示KIF20A的表达在膀胱癌中显著升高，KIF20A高表达患者的平均生存期明显短于低表达患者[31]。下调KIF20A能有效抑制HCC细胞的增殖，增加其G1期阻滞作用，因此KIF20A可能作为HCC患者生存的预后生物标志物和潜在的治疗靶点[32-33]。

综上所述，本研究通过生物信息学方法获得了HCC中与预后密切相关糖酵解基因，进一步分析显示B3GAT3、NDC1、KIF20A高表达与HCC患者的不良预后显著相关，也许是HCC患者潜在的生物标志物。本研究为HCC预后生物标志物的研究提供了新线索和新思路，为后续的实验研究提供了理论参考依据。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL26976)。所有试验过程均遵照《人体医学研究的伦理准则》的条例进行。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No.QYFYWZLL26976), and all experimental protocols were carried out by following The Ethical Guidelines for Human Medical Research. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者贡献：曹景玉、朱呈瞻、李坤、刘奎参与了研究设计；解宇威、刘鹏、徐翔宇、高瑞谦、高雨菲参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions： The study was designed byCAOjingyu,ZHUChengzhan,LIKun, andLIUKui. The manuscript was drafted and revised byXIEYuwei,LIUPeng,XUXiangyu,GAORuiqian, andGAOYufei. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.