基于网络药理学及分子对接预测金雀花降血压的活性成分及作用机制

布比阿加尔·哈依拉提，李 洋，秦亚迪，姚 军，程煜凤，沈 静

（新疆医科大学1药学院，2第五附属医院药剂科，乌鲁木齐 830011）

金雀花（Caragana sinica）为豆科蝶形花亚科锦鸡儿属植物锦鸡儿的成熟干燥花[1]，主要化学成分为黄酮、生物碱、萜类、甾醇等化合物[2]。金雀花已有多年用药历史，主要用于肺虚久咳、多血症以及高血压等多种疾病的治疗[3-4]。本课题组前期研究证实金雀花对肾性高血压大鼠有较好地降压作用[4]，但对其降压物质基础及机制尚未有研究。网络药理学是一个集系统生物学、信息科学以及药理学的新兴研究领域，可以可视化化合物与靶点之间复杂的相互作用，以推进药物的研发[5]。分子对接是通过计算机模拟分子间相互识别，空间匹配和能量匹配过程的一种计算机技术。中药化学成分复杂，其中的多种有效成分和多个靶点相互作用发挥药效，网络药理学的系统性、全面性与中医药辩证论、整体观等观念基本一致，结合分子对接技术进行初步验证，可以很好的解释中药通过多种途径产生药理作用，为中医药的研究提供了新的思路。本研究通过网络药理学探究金雀花降血压的物质基础及作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 金雀花活性成分的筛选通过检索CNKI、万方、维普及TCMSP 等数据库对金雀花的化学成分进行收集，将其依次输入Pubchem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），得到化学结构，再通过ChemDram软件画出化合物SDF 结构，将其输入Swiss ADME 数据库（http://old.swissadme.ch/），在显示的报告中，以“GI absorption:High”且“Lipinski:Yes,0 violation”为筛选标准，在Swiss ADME 数据库中“GI absorption”参数代表胃肠道吸收，“Lipinski”参数根据Lipinski类药5原则[6-7]，即根据小分子：（1）键供给数；（2）相对分子质量；（3）脂水分配系数logP；（4）氢键受体数目；（5）可旋转键数目等参数综合考量小分子类药性，最终选择胃肠道吸收性较好，且类药性较好的化合物为金雀花降血压活性成分。

1.2 金雀花活性成分的靶点预测将筛选出的金雀花化学成分依次输进Swiss Target Prediction 数据库（http://old.swisstargetprediction,ch/），获取化合物相关的预测靶点，将得到的靶点通过Uniprot 数据库（http://www.uniprot.org/uniprot/）进行勘正，再经 Uniprot 进行检索时应选择Reviewed（已证明）和Human（人）物种来进行准确校准，获得金雀花活性成分的靶点。

1.3 高血压靶点的收集通过GeneCards 数据库（https://genecards.org），以“Hypertension”为关键词进行检索，以相关分数（Relevance score）≥10 为条件选出相关性高的靶点，经过去重、合并后收集得到高血压相关靶点。

1.4 金雀花-高血压交集靶点的获取将筛选出的金雀花预测靶点和收集的高血压靶点输入Venny2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)制得韦恩图，得到交集基因，获取金雀花活性成分降血压的潜在靶点。

1.5“金雀花-成分-高血压-靶点”网络图的绘制将金雀花活性成分的靶点以及高血压的靶点导入Cytoscape3.8.0 软件，制作“金雀花-化学成分-高血压-靶点”网络图。

1.6 蛋白-疾病互作（PPI）网络图的构建将金雀花有效成分和高血压共同靶点导入String 数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl），限制物种为人，隐去游离点，设定最小相互作用分数为0.4，得到关键作用靶点，再将关键作用靶点导入Cytoscape 软件，得到金雀花有效成分靶点蛋白-高血压靶点蛋白相互作用（PPI）网络图。

1.7 生物通路分析与功能富集分析将金雀花活性成分和高血压交集靶点导入Metascape 数据库（http://metascape.org/），物种选择“sapiens”，作KEGG 通路分析和GO生物富集分析，根据得到的数据绘制KEGG气泡图和3种GO分析的柱状图，以及利用KEGG Mapper工具绘制靶点通路图并对得到的结果进行分析。

1.8 分子对接的方法将经过筛选得到的8种金雀花化学成分和得到的前8个核心靶点进行分子对接，将降压药卡托普利作为阳性对照药。金雀花化学成分及阳性药的分子结构从TCMSP 数据库（http://pubchem.nc-bi.nih.gov/）和 Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中进行下载，核心靶点的分子结构则从PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）中进行下载,将下载好的靶点蛋白质导入Pymol 软件进行去水，去配体等前处理，再将其与下载好的金雀花化学成分及阳性药的结构文件导入Auto Dock Tool软件进行半柔性分子对接，对接采用blind docking 的对接方法，即Grid box 完全包裹住靶点蛋白。对接次数设定为50次，其余参数默认。

2 结果

2.1 金雀花活性成分筛选结果以“金雀花”为关键词检索相关文献及TCMSP 数据库，共获得21 种化学成分，见表1；将这21 种化学成分导入Swiss ADME 数据库中进行筛选，共选出8种化合物满足胃肠道吸收性较好且类药性较好的限定条件，故将其定为本研究中金雀花活性成分，见表2。

表1 金雀花化学成分筛选结果

表2 金雀花活性成分筛选结果

2.2 金雀花活性成分靶点筛选结果将筛选出的金雀花活性成分依次输进Swiss Target Prediction 数据库，获取化合物相关预测靶点，再将得到的靶点通过Uniprot 数据库进行勘正，共得到了192 个金雀花活性成分靶点。

2.3 高血压靶点筛选结果在GeneCards 数据库以“Hypertension”为关键词进行检索，以相关分数（Relevance score）≥10 为条件进行筛选，去重后共得到3 323个与高血压相关的靶点。

2.4 金雀花-高血压交集靶点筛选结果将得到的高血压相关靶点和金雀花活性成分靶点通过在线绘图软件取得交集，得到高血压靶点2 996 个约占总靶点数的94%，得到金雀花靶点60 个约占总靶点数的1.9%，得到金雀花-高血压交集靶点132 个约占总靶点数的4.1%，并绘制金雀花-高血压韦恩图，见图1。

图1 金雀花化学成分靶点与高血压靶点Venn图

2.5“金雀花-成分-靶点-高血压”网络图的绘制通过Cytoscape 软件对选出的132 个交集靶点以及对应的8 种活性成分作网络图（见图2），得到142个节点，655 个连线，在图中八边形表示金雀花，六边形表示金雀花8 种活性成分，菱形表示靶点，圆形表示高血压，图中一个节点连接的线的数量称为该节点的度值，度值与对应节点连线的数量成正比，图中图形越大，表明与之连接的节点越多（见表3），说明其在该网络中越重要，可以从网络图中看出金雀花化学成分7,4'-二羟基黄酮、金合欢素、樱花素、芫花素、异鼠李素、槲皮素、芹菜素等在金雀花降血压过程中发挥重要的作用。

表3 金雀花化学成分度值信息

图2 “金雀花-成分-靶点-高血压”网络图

2.6 蛋白-疾病互作（PPI）网络图的绘制以及关键靶点将金雀花活性成分与高血压共同靶点输入String数据库，得到PPI网络图数据，将得到的数据导入Cytoscape 软件，得到网络图，再对网络图进行分析，计算出度值的平均值为19，将大于19 的所有结点节选出来，得到55 个关键靶点，绘制PPI 网络图，见图3；图形越大，颜色越深说明该靶点越重要。根据度值排名选出前30个为核心调控靶点，见图4。

图3 金雀花-高血压PPI网络图

图4 金雀花降血压排名前30的核心调控靶点

2.7 KEGG 通路分析及GO 富集分析将金雀花活性成分和高血压交集靶点导入Metascape 数据库，进行KEGG 通路分析，共有160 条相关通路数据，对数据按Count≥10 为条件进行筛选，选出51 条符合条件的通路，导出数据，利用R 语言绘制KEGG 通路气泡图，见图5。图中X 轴代表金雀花活性成分和高血压交集靶点的富集情况，Y 轴表示与金雀花活性成分相关的KEGG 通路，图中气泡颜色越红越亮则代表显著性越高，气泡面积越大表示汇集在该通路上的靶点越多。由图可知，金雀花主要是通过癌症通路（Pathways in cancer）、PI3K-AKT 信号通路（PI3K-AKT signaling pathway）、Ras 信号通路（Ras signaling pathway）、丝裂素活化蛋白激酶信号通路（MAPK signaling pathway）等通路发挥降血压的作用。KEGG 通路分析结果表示除了癌症通路，富集在PI3K-AKT 信号通路的靶点最多，有25 个。通过绘制PI3K-AKT 信号通路图，见图6。可以看出金雀花化学成分是通过作用于多个靶点多条通路发挥降血压作用。在Metascape 数据库中选择 GO-BP、GO-CC、GO-MF 3种GO 富集分析，分别得到319条BP通路，30个CC过程，以及23 个MF 功能。按-LogQ 值的升序排序，选出前20 个GO 注释，将其绘制成柱状图（见图7）。由图可见，GO注释多与BP和MF相关，如磷酸转移酶活性、激酶活性、蛋白质磷酸化、信号转导等。

图5 交集靶点KEGG通路富集分析

图6 金雀花化学成分靶点在PI3K-AKT信号通路的分布图

图7 金雀花-高血压交集靶点GO分析

2.8 金雀花-高血压分子对接从排名前30 的靶点中，选取度值最大的前8 个靶点做分子对接，见表4。将8 个金雀花活性成分以及阳性药卡托普利（Compound CID:44093;CAS:62571-86-2）的分子结构文件和经过前处理的靶点蛋白进行分子对接，对接结果均小于0 kcal/mol，说明配体和受体能自发结合；对接结果小于-4.0 kcal/mol，说明配体和受体之间有较好的结合活性；对接结果小于-7.0 kcal/mol，说明配体和受体具有较强的结合活性。对8 个金雀花活性成分及1 个阳性药分子与8 个靶点蛋白对接的最低结合能作热图（如图8），其中横坐标表示靶点蛋白，纵坐标表示金雀花活性成分，颜色越深表示最低结合能越小。如图所示所有分子和靶点蛋白的最低结合能均小于0 kcal/mol，说明金雀花活性成分和靶点都能自发结合。最低结合能越小表明分子和靶点结合越好，如7,4'-二羟基黄酮和EGFR 最低结合能为-8.0 kcal/mol，说明7,4'-二羟基黄酮和EGFR 不仅能自发结合，且两者具有较强的结合活性，能较好结合从而发挥药理作用。对接结果表明，金雀花活性成分的最低结合能均小于阳性药卡托普利，说明金雀花这8个活性成分与这些靶点的结合活性均强于卡托普利。选取结合活性较强的芹菜素与AKT1、儿茶素与AKT1，7,4'-二羟基黄酮与EGFR借助Pymal软件分别进行分子对接以及结合位点局部放大可视化，可更直观的表示金雀花活性成分与靶点的结合情况，见图9。由图9A 可知，儿茶素和AKT1 的CLU-278、ASN-279、LEU-295、TYR-229 4 残基形成了 7 个氢键，且氢键长度分别为2.0、2.5、2.1、2.2、2.8、1.9、1.9。

图9 分子对接模式图

表4 度值排名前8的靶点信息

3 讨论

通过本研究发现金雀花降血压作用涉及金雀花中多种活性成分，如儿茶素、7,4'-二羟基黄酮、樱花素等，查阅文献发现这些成分在一定程度上通过不同机制能起到降血压作用，如儿茶素通过抑制MAPKs信号通路发挥降压作用[8]。通过PPI靶点网络和GO及KEGG分析发现金雀花降血压网络涵盖了多个与高血压疾病相关的靶点、生物过程、分子功能、疾病通路、信号通路等,如蛋白激酶1（AKT1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）等蛋白靶点，如磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Ras 信号通路（Ras signaling pathway）、丝裂素活化蛋白激酶信号通路（MAPK signaling pathway）等信号通路，查阅文献发现这些靶点和通路在一定程度上都与高血压相关[9-12]。如AKT1 通过刺激内皮一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化，生成NO，产生扩血管作用，从而起到降血压作用[13]，VEGF 通过促进NO 介导的血管舒张来影响血压[14]。如研究PI3K/Akt信号通路发现，通过该通路可激活eNOS 的磷酸化，eNOS 催化血管中NO 的合成，从而起到降血压作用[15]。血管平滑肌细胞（VSMC）的表型转换会影响包括高血压在内的心血管疾病的发展，而最近有研究表明VSMCs 的表型转换受Akt 和MAPK 信号之间平衡的调节，说明MAPK信号在高血压发展中也发挥着重要作用[16]。有研究表明Rap1 被剪切应力激活，促进内皮机械传感复合物整合素和钙黏蛋白的形成，促进NO 的生成，该研究说明Rap1 信号通路在心血管疾病中具有广泛的影响[17]。

本研究通过分子对接实验初步验证网络药理学结果，发现经过网络药理学筛选的8个活性成分与度值较高的前8 个高血压相关靶点具有较强的结合活性，表明金雀花可通过多种成分、多个靶点、多条通路发挥降血压作用，为深入研究其具体作用机制提供了基础。