经TACE 治疗的肝细胞癌患者外周血单个核细胞中沉默信息调节因子7 的表达及其与预后的关系

卢金兰 王丽丽 卢 哲

肝细胞癌（HCC）是一种富血供的恶性肿瘤，90%以上的血供来自于肝动脉[1]。经导管动脉化学治疗栓塞术（TACE）可有效阻断肿瘤的血供，并将化学治疗药物集中靶向肿瘤病灶，已成为治疗HCC 常用的非手术方法之一。研究报道，HCC 在中国的发病率较高，约占全球HCC 新发病例总数的55%[2]。近年来，随着肿瘤治疗技术的发展，HCC 的病死率显著降低[3]。研究发现，给予相同肿瘤分期的HCC 患者TACE 治疗后存在预后差异较大的情况[4]，因此，探究能够准确评估TACE 治疗预后的生物标志物具有重要意义。

沉默信息调节因子7（SIRT7）是去乙酰化酶Sirtuins 家族中的一员，已被报道可通过靶向p53依赖性细胞死亡途径调控HCC 细胞对阿霉素的敏感度[5]，并可调节HCC 细胞的生长、增殖及肿瘤免疫微环境等[6-8]。因上述机制均与TACE 治疗的临床获益关系密切，由此推测SIRT7 的表达水平可能与经TACE 治疗的HCC 患者预后有关。本文检测了经TACE 治疗的HCC 患者外周血单个核细胞中SIRT7 的表达水平，并分析其与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选择2016 年6 月至2018 年3 月在武警北京市总队医院就诊的104 例HCC 患者作为研究对象。参照《原发性肝癌诊疗规范（2011 年版）》[9]诊断HCC。纳入标准：（1）首次确诊并接受TACE治疗；（2）Child-Pugh 分级为A 级或B 级；（3）预计生存期＞3 个月。排除标准：（1）HCC 分期为Ⅲb 期或Ⅳ期；（2）对碘对比剂过敏；（3）存在TACE 治疗禁忌证，如肝肾功能严重障碍、无法纠正的凝血功能严重减退等；（4）年龄＞80 岁；（5）接受过射频消融或微波消融治疗。所有入组患者均签署了知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 TACE 治疗方案

所有入组患者在TACE 治疗前均进行血常规、尿常规、凝血功能、肝肾功能及心电图等常规检查，收集患者的年龄、性别、Child-Pugh 分级、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）、肿瘤直径、肿瘤数量、肿瘤分期及治疗方案等信息。采用Seldinger 技术经股动脉穿刺插管至腹腔动脉，行血管造影，明确HCC 的供血动脉。通过CT 或MRI 检查明确是否存在肝外供血动脉。经肝动脉灌注化学治疗药物奥沙利铂（100 mg/m2）和5-氟尿嘧啶（500 mg/m2），并注入已充分乳化的阿霉素（40 mg/m2），然后与超液化碘油混悬液栓塞，最后用明胶海绵颗粒栓塞，栓塞终点为栓塞血管呈“干树枝”状。根据HCC 的大小及血供情况决定乳化剂用量，最大程度做到完全栓塞。TACE 治疗后常规给予保肝、止吐、营养支持及镇痛等治疗，密切观察有无并发症发生。医嘱患者在TACE 治疗后4 周复诊，观察碘油沉积、HCC 组织坏死及有无新的HCC 病灶等情况[10]。

1.3 SIRT7 表达水平检测

采用Ficoll 密度梯度离心法提取外周血中的单个核细胞。抽取HCC 患者TACE 治疗前和治疗后（首次治疗后7 d）的空腹肘部静脉血10 mL，PBS溶液稀释，置于Ficoll 分离液中低温离心、分离；PBS 溶液重悬，再次离心，重复2 次，吸取单个核细胞。采用蛋白质印迹法检测单个核细胞中SIRT7的表达水平[11]。步骤如下：（1）使用含蛋白抑制剂的RIPA 溶液裂解单个核细胞，离心，提取总蛋白；（2）使用BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量；（3）在80 V 电压下凝胶电泳15 min，然后电压升至120 V，直至溴酚蓝跑出胶面；（4）缓冲液漂洗，转膜；（5）5%脱脂奶粉封闭2 h，滴加一抗（购自武汉菲恩生物科技有限公司），4 ℃环境下孵育过夜；（6）缓冲液漂洗，滴加二抗（购自武汉菲恩生物科技有限公司），室温下孵育2 h；（7）曝光显影，应用ImageJ 1.8.0 软件读取实验图像。

1.4 随访

采用电话和复诊方式了解患者的预后生存情况。在HCC 患者出院后4 周采用复诊方式进行首次随访，之后每3 个月随访1 次，为期36 个月，末次随访时间为2021 年3 月2 日，以患者死亡作为随访终点事件。

1.5 统计学分析

应用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例（%）表示。采用重复测量方差分析法比较生存组和死亡组治疗前后SIRT7 的表达水平。采用ROC 曲线评估SIRT7 判断经TACE 治疗的HCC 患者预后的效能。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，用logrank 检验比较生存曲线的差异。采用Cox 比例风险回归模型对经TACE 治疗的HCC 患者的预后影响因素进行单因素和多因素分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 患者的临床特征

104 例HCC 患 者 中 男 性68 例，女 性36 例；年龄48～70 岁，平均年龄为（62.11±4.56）岁；Child-Pugh 分级为A 级有78 例，B 级有26 例；肿瘤分期为Ⅰb 期有9 例，Ⅱ期有44 例，Ⅲa 期有51 例；HBsAg 阳性有86 例，阴性有18 例；AFP＞400 g/L有61例，≤400 g/L有43例；肿瘤直径＞5 cm有50例，直径≤5 cm 有54 例；肿瘤单发有40 例，多发有64 例；伴血管侵犯有51 例；接受1 次TACE 治疗者有68 例，而≥2 次者有36 例；后续接受索拉非尼治疗有11 例，接受利卡汀治疗有13 例。

2.2 两组的SIRT7 相对表达水平比较

与治疗前比较，生存组和死亡组治疗后SIRT7的表达水平均较低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。与死亡组比较，生存组治疗前和治疗后SIRT7 的表达水平均较低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见图1、图2。

图1 两组SIRT7 的蛋白质印迹图

图2 两组SIRT7 的相对表达量

2.3 SIRT7 判断经TACE 治疗的HCC 患者预后的效能

治疗前SIRT7 水平判断经TACE 治疗的HCC患者预后生存的ROC 曲线下面积（AUC）、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.750（95%CI：0.648～0.853）、1.85、63.64% 和83.10%；治 疗 后SIRT7 水平判断HCC 患者预后生存的AUC、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.894（95%CI：0.828～0.959）、1.23、75.76%和88.73%；治疗前后SIRT7 水平差值判断HCC 患者预后生存的AUC、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.567（95%CI：0.444～0.691）、0.60、48.48%和70.42%。以上结果显示，治疗后SIRT7 水平判断HCC 患者预后的AUC大于治疗前SIRT7 及治疗前后SIRT7 水平的差值，差异均有统计学意义（Z＝2.299，P＝0.022；Z＝5.645，P＜0.001）。见图3。

2.4 SIRT7 的表达水平与经TACE 治疗的HCC 患者预后的关系

根据104 例HCC 患者SIRT7 的相对表达量的中位数（1.15），将患者分为SIRT7 高表达组（n＝48）和SIRT7 低表达组（n＝56）。SIRT7 高表达组的中位生存时间为25 个月，短于SIRT7 低表达组（36 个 月），差 异 有 统 计 学 意 义（log-rankχ2＝18.261，P＜0.001）。见图4。

图3 SIRT7 判断经TACE 治疗的HCC 患者预后的ROC曲线

2.5 影响经TACE 治疗的HCC 患者预后生存的相关因素

将104 例HCC 患者的预后生存情况作为因变量，将患者年龄、性别、Child-Pugh 分级、肿瘤分期、HBsAg、AFP、肿瘤直径、肿瘤数量、TACE 治疗次数、索拉非尼、利卡汀和治疗后SIRT7 水平作为自变量，纳入Cox 单因素回归分析，结果显示肿瘤分期、肿瘤直径、索拉非尼、利卡汀和治疗后SIRT7 水平与经TACE 治疗的HCC 患者预后生存有关（P＜0.05）。将104 例HCC 患者的预后生存情况作为因变量，将单因素分析中P＜0.10 的项目，包括Child-Pugh 分级、肿瘤分期、肿瘤直径、索拉非尼、利卡汀和治疗后SIRT7 水平作为自变量，纳入Cox 多因素回归分析，结果显示肿瘤分期、肿瘤直径和治疗后SIRT7 是经TACE 治疗的HCC 患者预后生存的独立危险因素（P＜0.05），索拉非尼和利卡汀是其独立保护因素（P＜0.05）。见表1。

图4 SIRT7 高表达组和低表达组的生存曲线

表1 影响经TACE 治疗的HCC 患者预后生存的单因素和多因素Cox 比例风险回归分析

3 讨论

SIRT7 是唯一存在于细胞核中的Sir2 家族成员，是RNA 聚合酶Ⅰ转录的激活因子[12]，参与了肝脏脂质代谢、线粒体稳态、染色体结构和转录功能调节等过程[13-15]。另有研究显示，SIRT7 参与了HCC、胃癌等的发生和发展过程[5-8,16]。本文主要探讨了经TACE 治疗的HCC 患者外周血单个核细胞中SIRT7 的表达水平与患者预后的关系。

本研究结果显示，生存组和死亡组治疗后SIRT7 的表达水平均低于治疗前，且生存组治疗前后SIRT7 的表达水平均低于死亡组，这提示外周血单个核细胞中SIRT7 的表达水平与HCC 患者的预后生存情况可能有关。本研究进一步构建了SIRT7预测HCC 患者预后生存的ROC 曲线，结果显示治疗后SIRT7 水平判断经TACE 治疗的HCC 患者预后生存的AUC 大于治疗前SIRT7 水平和治疗前后SIRT7 水平的差值，这提示治疗后SIRT7 水平可辅助评估经TACE 治疗的HCC 患者的预后情况。

本研究结果显示，SIRT7 高表达组的中位生存时间短于SIRT7 低表达组，这提示SIRT7 的表达水平与HCC 患者的预后有关。本研究指出，治疗后SIRT7 水平是经TACE 治疗的HCC 患者预后生存的独立危险因素，推测其原因可能是SIRT7 可参与调控HCC 细胞对化学治疗药物的敏感度，并可调节HCC 细胞的生长、增殖及肿瘤免疫微环境等[5-8]，进而可反映患者的预后情况。此外，本研究结果还显示肿瘤分期和肿瘤直径是HCC 患者预后的独立危险因素，索拉非尼和利卡汀是其独立保护因素，这与既往报道结果相符[17-19]。

综上所述，经TACE 治疗的HCC 患者外周血单个核细胞中SIRT7 的表达水平与患者预后生存情况有关。本研究仅检测了HCC 患者治疗前及首次接受TACE 治疗后7 d 的外周血单个核细胞中SIRT7 的表达水平，尚不能确定判断HCC 患者预后的SIRT7 的最佳检测时间点，下一步将增设SIRT7 的检测时间点，以弥补本研究的不足。此外，今后还需开展大样本、前瞻性研究以验证本研究的结论。