超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法定量分析云南大叶种茶酚类成分
2022-05-09施丽娟范晓伟胡永丹易伦朝任达兵
施丽娟,陈 宁,王 丹,范晓伟,胡永丹,易伦朝,任达兵*
(昆明理工大学食品科学与工程学院,云南 昆明 650500)
中国是全世界最大的茶叶生产国,2020年茶叶产量达到297.00万 t[1]。其中,云南省2020年的茶叶产量高达46.60万 t,占全国茶叶总产量的15.70%[2]。不同于其他茶叶产区,云南茶叶主要采用其特有的大叶种茶(Camellia sinensisvar.assamica)的鲜叶作为原料。研究表明,大叶种茶比小叶种茶具有更高含量的茶多酚,尤其是儿茶素类成分[3]。云南产区主要生产绿茶、红茶和普洱茶(生茶和熟茶)。
滋味是评价茶叶风味和品质的关键因子,且与儿茶素、酚酸、黄酮等酚类成分之间存在密切关系[4]。研究表明,茶汤苦味和涩味的强度与酚类成分的总含量呈正相关[5]。非酯型儿茶素是茶汤苦味的主要贡献者,而酯型儿茶素、黄酮醇糖苷和单宁是主要的涩味成分[6]。此外,黄酮醇苷能够增强咖啡碱的苦味,没食子酸和茶没食子素则对茶汤鲜味起到增强作用[7-9]。茶黄素类成分是形成红茶汤色“透亮”和提高茶汤鲜爽度的重要成分[10-11]。不同类型的茶叶由于加工工艺不同而导致内含成分的组成和含量存在较大差异。鉴于多酚类成分对茶叶滋味品质和营养活性具有关键作用,定量剖析不同类型茶叶中酚类成分组成和含量的差异具有重要意义。
超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupoletandem mass spectrometry,UPLC-QQQ-MS/MS)联用技术是化学成分定量分析的强大工具。UPLC-QQQ-MS/MS具有分析时间短、灵敏度高、特异性强等优点,非常适合于多类成分及低含量成分的准确定量分析。目前,该技术已成功应用于柑橘、豆类、葡萄酒、茶叶样本中酚类成分的准确定量分析[12-15]。尽管UPLC-QQQ-MS/MS在定量分析方面具有诸多优势,但利用该技术实现茶叶中儿茶素、酚酸以及黄酮等酚类成分同时定量分析的研究尚比较缺乏。
本研究旨在建立一种能够同时准确测定茶叶中不同类别多个酚类成分的UPLC-QQQ-MS/MS定量分析方法。在此基础上,对不同类型云南大叶种茶叶样本(绿茶、红茶、普洱生茶、普洱熟茶)酚类成分的组成和图谱进行多元统计分析,最终揭示不同类型茶叶在酚类成分上的特征及差异。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茶叶样本采自于云南省的5个主要茶产区,包括西双版纳、临沧、普洱、保山和大理。共99 份样本,包括绿茶34个,红茶26个,普洱生茶20个,普洱熟茶19个。茶叶样本经过干燥后,粉碎并过60 目筛滤后,-20 ℃冰箱中保存备用。
甲酸(质谱级)、乙腈(质谱级)、甲醇(分析级)德国Merck公司;本工作共采用90个化学标准品由慧嘉生物科技有限公司、成都曼斯特生物科技有限公司、西宝生物科技有限公司提供。
1.2 仪器与设备
Nexera XR超高效液相色谱仪、LCMS-8040三重四极杆质谱仪 日本岛津公司;FSJ-A05B1粉碎机 广东小熊电器有限公司;FAMO-10F超滤型超纯水机 南京权坤生物科技有限公司;SK5200BT超声仪器 上海科导超声仪器有限公司;MS105DU电子分析天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司;TGL-16M超速离心机 湘仪仪器有限公司;100~1 000 μL手动移液枪 德国艾本德股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 混标溶液的制备
准确称取90个对照标准品各1.5 mg于2 mL离心管中,加入适量70%甲醇溶液溶解。将离心管中的溶液转移至5 mL容量瓶中,加入70%甲醇溶液定容后获得质量浓度为300 μg/mL的混标储备液,置于冰箱中避光保存待用。
1.3.2 样品制备
参考课题组前期优化的方法[16],准确称取茶叶粉末0.1 g置于5 mL离心管中,加入4 mL 70%甲醇溶液后50 ℃超声提取30 min。将提取液10 000 r/min离心10 min后,吸取上清液并利用UPLC流动相稀释10 倍。取适量过0.22 μm有机滤膜后用于UPLC-QQQ-MS/MS分析。
1.3.3 UPLC-QQQ-MS/MS条件
色谱仪主要由UPLC分离系统和三重四极杆质谱检测系统串联组成。其中,UPLC系统包括二元泵、自动进样器、柱温箱等模块。
UPLC条件:ACQUITY UPLC®HSS C18色谱柱(100 mmh 2.1 mm,1.8 μm),柱温35 ℃,进样量1 μL。流动相为0.1%甲酸(A)和乙腈(B),流速0.3 mL/min,梯度洗脱:0~1 min,90%~87% A,10%~13% B;1~2 min,87%~83% A,13%~17% B;2~3 min,83%~80% A,17%~20% B;3~8 min,80%~75% A,20%~25% B;8~9 min,75%~68% A,25%~32% B;9~12 min,68%~55% A,32%~45% B;12~16 min,55%~50% A,45%~50% B。
MS条件:电喷雾离子源,采用负离子模式下的多反应监测(multi-reaction monitoring,MRM)模式进行质谱扫描。优化后的离子源参数如下:干燥气流速6 L/min,吹扫气流速1.5 L/min,接口电压4.5 kV,碰撞诱导解离气压230 kPa,离子传输管温度250 ℃,加热板温度400 ℃,检测电压2.08 kV。
1.3.4 方法学考察
考察包括标准曲线、检出限、定量限、精密度和加标回收率。储备液用70%甲醇溶液稀释不同倍数,获得不同质量浓度的混标溶液(0.01~300 μg/mL),然后进行UPLC-QQQ-MS/MS分析。以目标物实际质量浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,通过回归拟合获得各成分的标准曲线。检出限和定量限分别以信噪比3 倍和10 倍进行计算。精密度包括日内和日间精密度,选取高(100 μg/mL)、中(10 μg/mL)、低(0.5 μg/mL)3个质量浓度的混标溶液,分别在1 d内(6次)和5 d内重复进样(6次/d)。计算各成分含量的日内和日间相对标准偏差,用以表征日内和日间精密度。采用样品加标回收法进行回收率实验,即将高、中、低3个质量浓度的混标溶液加入茶叶样品中进行检测。测定加入标准品的质量浓度,然后通过比较实际质量浓度和测定质量浓度计算回收率。
1.4 数据处理
原始数据由仪器自带的Labsolution软件(Shimadzu,Japan)完成,经峰面积提取、标准曲线拟合等步骤后,最终获得各目标物的质量浓度(mg/mL)。根据稀释倍数、提取溶液体积和干茶粉末加入量,将质量浓度转化为茶叶中的目标物的含量(mg/kg,干质量)。
使用SPSS软件进行方差分析,P<0.05,差异显著。应用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)进行偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)。
2 结果与分析
2.1 分析方法建立
如图1A所示,乙腈能够提供更好的分离性能,目标物彼此之间能够有效分开。此外,绝大部分目标物的质谱响应随甲酸体积分数(0.05%~0.5%)的增大而降低(图1B)。其中,甲酸体积分数为0.1%时洗脱色谱峰的数量达到最多,因此确定该体积分数为最佳。当流速从0.2 mL/min增加到0.4 mL/min时,几乎所有色谱峰的保留时间均减小,但过大的流速(0.4 mL/min)并不利于同分异构体的分离。如图1C所示,化合物43、44、45在流速为0.4 mL/min时不能获得有效分离(分离度1.04),但流速为0.2 mL/min和0.3 mL/min时彼此之间的分离度有所改善(分离度1.48,1.2)。综上,最佳流动相组成为乙腈和水,添加剂为甲酸(0.1%),流速为0.3 mL/min,并基于此进一步优化洗脱梯度。
图1 有机相(A)、甲酸体积分数(B)、流动相流速(C)对色谱-质谱分离分析效果的影响Fig.1 Effects of organic phase (A), formic acid concentration (B) and flow rate of mobile phase (C) on the performance of UPLC-MS/MS analysis
对质谱检测中的MRM模式进行考察和优化,包括检测离子对的优选、碰撞能量和检测电压的优化等。以儿茶素为例,首先选择离子扫描,确定其前体离子信息(m/z289.10)和碎裂电压,然后通过子离子扫描,确定子离子为m/z245.10、123.10、109.00。根据离子的响应强度和特异性,确定儿茶素的检测离子对为m/z289.10→245.10和m/z289.10→123.10。实验过程中,每个酚类成分至少需要一个离子对,最终确定90个目标物的共257个离子对。循环时间设置为0.8 s。
应用优化的UPLC-QQQ-MS/MS条件,成功对4类茶叶中的90个酚类成分进行同时分离分析。结果如图2所示,所有成分均能在16 min内获得有效分离。
图2 儿茶素(A)、酚酸(B)、黄酮(C、D)的总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of catechins (A), phenolic acids (B)and flavonoids (C, D)
2.2 方法学考察结果
标准曲线、检出限、定量限、精密度和准确度的测定结果如表1所示。儿茶素类、酚酸类、黄酮及其糖苷类化合物均在0.4~12 000 mg/kg内呈现良好线性关系(R2≥0.999 0)。检出限和定量限分别为0.000 4~3.939 2 mg/kg与0.001 2~13.130 0 mg/kg,表明方法具有较高的灵敏度。日内和日间精密度在高、中、低3个质量浓度下分别为0.57%~19.83%、0.39%~20.00%,表明仪器的稳定性较好。低、中、高3个质量浓度下,目标成分的回收率及其相对标准偏差分别在80.42%~118.92%和0.29%~19.94%之间,证明方法的准确性较好。因此,本工作建立的UPLC-QQQ-MS/MS定量分析方法具有良好的准确性和精密度。
表1 UPLC-QQQ-MS/MS方法的线性方程、相关系数(R2)、线性范围、检出限、定量限、日内和日间精密度、回收率Table 1 Linear equations, correlation coefficients (R2), linear ranges, LOD, LOQ, intra-day and intra-day precision and recoveries of UPLC-QQQ-MS/MS method
续表1
2.3 云南大叶种茶酚类成分含量分析
应用建立的UPLC-QQQ-MS/MS方法,对云南产4类茶叶(绿茶、红茶、普洱生茶和普洱熟茶)90个成分进行准确定量和比较分析,结果如表2所示。本工作共检测出62种酚类成分,包括儿茶素类16种,酚酸类18种,黄酮类28种。对于未检测到的28种成分,可能是因为其含量远低于检出限,或者四类茶叶中不存在这些成分。结果表明,检出成分在不同类型茶叶中的含量分布范围较广,含量介于4.06~86 088.96 mg/kg之间。如图3所示,三类酚性成分的总含量(单个成分含量的加和)均在未发酵茶(绿茶或普洱生茶)中最高,而在红茶和普洱熟茶中的含量相对较低(红茶>普洱熟茶)。众多研究表明,无论是依靠内源酶的全发酵(红茶)还是微生物参与的后发酵(普洱熟茶),均能显著降低茶叶酚类成分的含量[5,17-18]。本研究的准确定量结果进一步证实了上述结论,且酚类成分的含量在微生物参与的后发酵过程中下降幅度更大。
表2 茶叶样本中检测到的酚类成分含量Table 2 Contents of phenolic compounds detected in tea samples
图3 四类云南大叶种茶中总儿茶素、总酚酸和总黄酮含量比较Fig.3 Comparison of contents of total catechins, total phenolic acids and total flavonoids in four types of Yunnan large-leaf tea
儿茶素是茶叶中高含量成分和主体呈味物质,其中非酯型儿茶素是茶汤苦味的主要来源,而酯型儿茶素是主要的涩味成分[19-20]。本工作测定了简单儿茶素、酯型儿茶素、原花青素和茶黄素4个子类共16个儿茶素类成分的含量。如表2所示,儿茶素化合物的组成和含量分布方面,绿茶和普洱生茶之间较为相似,而红茶和普洱熟茶比较接近。除茶黄素类成分在红茶中具有更高的含量外,其余成分在绿茶和普洱生茶中的含量均更高。其中,表没食子儿茶素没食子酸酯(9,化合物编号,下同)和表儿茶素没食子酸酯(6)分别为绿茶(86 088.96 mg/kg)和普洱生茶(70 291.34 mg/kg)中含量最高的成分。红茶和普洱熟茶中含量最高的儿茶素类成分则分别为表儿茶素没食子酸酯(6,5 498.38 mg/kg)和表儿茶素(3,2 557.96 mg/kg)。茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(13,5 394.34 mg/kg)在红茶中的含量也较高,研究表明,茶黄素主要来源于红茶发酵过程中简单和酯型儿茶素的氧化聚合反应[21-22],本工作进一步表明该类成分是红茶的特征性成分。原花青素是儿茶素(2)和表儿茶素(3)的低聚体,具有涩味且呈味持久性较好,主要存在于绿茶和普洱生茶中[23-24],其中原花青素B2(15)的含量最高(4 376.00 mg/kg和4 021.22 mg/kg)。整体看来,未发酵茶(绿茶和普洱生茶)具有更丰富的儿茶素类成分,这也是两类茶叶比红茶和普洱熟茶具有更强苦涩味的重要原因。
酚酸类成分在四类茶叶中呈现明显不同的含量分布特征,结果如表2所示。首先,七叶亭(30)仅在红茶(428.55 mg/kg)样本中检出。没食子酸(29)、水杨酸(22)、原儿茶酸(24)和对香豆酸(28)等简单酚酸均在红茶或普洱熟茶中具有更高的含量。没食子酸是普洱熟茶中含量最高的酚类成分(8 235.20 mg/kg),同时在红茶中的含量也较高(5 249.05 mg/kg)。研究表明,普洱熟茶渥堆发酵过程中,没食子酸、水杨酸、原儿茶酸等苯甲酸衍生物的含量能够显著升高[25]。酯型儿茶素(如表没食子儿茶素没食子酸酯,9)和酚酸酯化物(如没食子素,38)等成分在单宁酶的作用下发生降解是导致该类成分含量增加的重要原因之一[26-27]。相比之下,简单酚酸的酯化产物和糖基化产物,如没食子酸甲酯(32)、松柏苷(37)、没食子素和绿原酸(39),均在绿茶或普洱生茶中具有更高的含量。红茶或普洱熟茶发酵的过程中,该类成分的糖苷键或酯键可能发生断裂,降解生成没食子酸等简单酚酸类成分。
黄酮及其糖苷类成分不仅是茶汤汤色的重要组成部分,而且黄酮糖苷对茶汤的苦味亦有重要贡献[8]。测定的黄酮类化合物主要包括游离黄酮醇、黄酮C-糖苷和黄酮O-糖苷,它们在4类茶叶中的含量分布并不一致(表2)。绿茶、普洱生茶、红茶和普洱熟茶中的含量最高的该类成分均为矢车菊素双葡糖苷(87),含量分别为18 163.64、20 185.00、9 149.42 mg/kg和3 650.25 mg/kg。黄酮糖苷整体上在绿茶和普洱生茶中具有更高含量。例如,芦丁(84)在绿茶和普洱生茶中的含量分别为4 619.80 mg/kg和4 674.54 mg/kg,显著高于红茶(2 350.63 mg/kg)和普洱熟茶(1 027.89 mg/kg)。相比之下,游离黄酮如山柰酚(51)、槲皮素(53)和杨梅素(57)的含量在红茶和普洱熟茶中的含量更高。上述结果表明,黄酮糖苷在绿茶和普洱生茶的加工中较稳定,但红茶和普洱熟茶的发酵过程中容易发生降解,进而产生山柰酚、槲皮素和杨梅素等游离黄酮。
2.4 四类云南大叶种茶的判别分析
基于62个化合物的准确含量数据集,进一步应用PLS-DA建立能够区分4类茶叶的分类模型。PLS-DA判别模型如图4A所示,R2、Q2和准确率分别为0.87、0.83、0.91,表明模型具有良好的可靠性和准确性。如图4A所示,普洱生茶与绿茶茶样之间重叠较为严重,表明两类茶叶在酚类成分的组成和含量上比较相近。除此之外,其余类型茶叶彼此之间均能获得良好区分,表明未发酵茶(绿茶和普洱生茶)、红茶和普洱熟茶在酚类成分的组成和含量上存在较大差异。绿茶和普洱生茶在加工过程中都采用高温使酶失活,导致仅有极少酚类成分发生氧化聚合反应,大部分酚类成分被保留下来。加工工艺的相似性是导致普洱生茶与绿茶的化学成分组成比较相近的主要原因。
图4 云南大叶种茶的PLS-DA(A)和差异性成分筛选结果(B、C)Fig.4 PLS-DA analysis (A) and identification (B and C) of differential components among four types of Yunnan large-leaf tea
基于PLS-DA分类模型,采用变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)法筛选能够区分4类茶叶的潜在化学标志物。以VIP值大于1.5为标准(图4B)[28],筛选出槲皮素(53)、七叶亭(30)、水杨酸(22)、茶黄素-3-没食子酸酯(11)、茶黄素-3’-没食子酸酯(12)、原儿茶醛(21)、茶黄素(10)、杨梅素(57)、异鼠李素(56)、茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(13)、牡荆素(61)共11个差异性成分。如图4C所示,茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯、茶黄素-3,3’-双没食子酸酯、水杨酸和七叶亭在红茶中含量较高,可作为区分红茶和其他类型茶叶的标志物群。槲皮素、原儿茶醛、杨梅素、异鼠李素和牡荆素在普洱熟茶中的含量较高,而在其他几类茶叶中含量相对较低。
由于多类分类模型无法将绿茶和普洱生茶进行有效区分,进一步应用PLS-DA对两类茶叶建立两两分类模型。如图5A所示,PLS-DA模型的R2、Q2和准确率分别为0.80、0.62、0.92,表明模型具有良好的可靠性和准确性,以VIP值大于1.5作为筛选条件(图5B),共筛选出绿原酸(39)、松柏苷(37)、表没食子儿茶素(4)、杨梅素(57)、没食子儿茶素没食子酸酯(8)、异夏佛塔苷(74)、隐绿原酸(40)、山柰酚(51)共8个差异成分。如图5C所示,松柏苷、表没食子儿茶素、杨梅素、没食子儿茶素没食子酸酯、异夏佛塔苷、山柰酚在绿茶中含量普遍更高,而绿原酸、隐绿原酸在普洱生茶中含量高于绿茶。
图5 绿茶和普洱生茶的PLS-DA模型(A)和差异性成分筛选结果(B、C)Fig.5 PLS-DA analysis (A) and identification (B and C) of differential components between green tea and Pu-erh raw tea
3 结 论
基于UPLC-QQQ-MS/MS技术,建立一种能够在16 min内同时对茶叶中90种酚类成分进行准确定量的分析方法。该方法具有较宽的线性范围(0.4~12 000 mg/kg,R2≥0.999 0),检出限和定量限分别为0.000 4~3.939 2 mg/kg和0.001 2~13.130 0 mg/kg,日内和日间精密度分别为0.57%~19.83%和0.39%~20.00%,加标回收率及其相对标准偏差分别为80.42%~118.92%和0.29%~19.94%,证明所建方法具有良好的线性范围、精密度和准确度。上述方法成功应用于4类云南大叶种茶中酚类成分的准确定量分析。结果表明绿茶、红茶、普洱生茶和普洱熟茶在酚类成分的组成和含量存在巨大差异。绝大部分酚类成分在未发酵茶(绿茶或普洱生茶)中含量较高,但游离酚酸、黄酮苷元和茶黄素在发酵茶(红茶或普洱熟茶)的含量更高。利用PLS-DA建立了区分不同类型茶叶的判别模型,并筛选到可用于区分4类茶叶的系列化学标志物。总之,本工作为茶叶中多个酚类成分的准确定量提供了新方法,且定量比较研究有助于进一步认识不同类型茶叶风味品质形成的物质基础。