GC-O结合OAV鉴定陇南初榨橄榄油关键香气成分

赵 玉，张玉环，李建科*，张 芬*

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710000）

油橄榄（Olea europaeaL.），作为世界四大木本油料作物之一，其栽培历史悠久。目前，该作物在我国的白龙江低山河谷区、金沙江干热河谷区和长江三峡低山河谷区广泛种植[1]。据统计，甘肃陇南油橄榄种植面积可达60万 亩，是全国最大种植基地[2]。油橄榄鲜果通过物理压榨制取的橄榄油素有“液体黄金”之称，因其富含多酚、维生素及不饱和脂肪酸等生物活性成分而备受消费者喜爱[3]。根据GB 23347ü2009《橄榄油、油橄榄果渣油》可将橄榄油分为初榨橄榄油、精炼橄榄油、混合橄榄油3 大类。其中初榨橄榄油的风味及营养组成与鲜果相似，是一种高档且重要的植物油。香气是产品品质的重要评价指标，明晰初榨橄榄油的呈香组成能够据此指导产业化加工技术改进。

目前橄榄油中已发现180多种挥发性物质，大致包括醛类、醇类及酯类等[4]。有研究发现橄榄油中富含C6醛和C6醇，这些物质对橄榄油中水果香和青草香两类优良呈香属性具有正向作用，是橄榄油风味形成的重要化合物[5]。它们广泛存在于多种橄榄油中，如Kesen等[6]在土耳其3种橄榄油中鉴定出己醛、(E)-2-己烯醛、3-己烯醛和己醇等8种C6醛和C6醇类物质；雷春妮等[7]利用热脱附-气相色谱-质谱联用技术解析10种初榨橄榄油的挥发性成分并发现己醇、己醛、(E)-2-己烯醛等是其主要呈香物质；此外，刘少敏等[8]采用气相色谱-嗅闻-质谱（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-OMS）并结合电子鼻在6种橄榄油中共鉴定出65种挥发性成分，同时发现小分子化合物是橄榄油中重要呈香物质。综上分析发现多数研究依靠物质含量多少判定橄榄油中重要香气物质，有利于初步了解其呈香物质组成规律，但橄榄油整体风味属性的呈现往往与某些物质紧密相关，这些物质称为关键香气成分。不同单体物质风味阈值具有差异性，因此单纯依靠物质含量判定橄榄油中关键香气成分具有局限性和不确定性，进而还需借助相关方法深入揭示橄榄油中的关键香气成分。

气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技术是以人的嗅觉作为检测器筛选香气活性物质的有效方法[9]，同时结合各组分贡献程度评价的关键指标香气活性值（odor activity value，OAV）可实现体系中关键香气成分的科学筛选。如Wang Yuanhui等[10]采用GC-O和OAV成功鉴定出中国传统饺子中关键香气成分；Liu Jie等[11]采用相同方法分析了一种市场接受度良好红糖的主要香气物质；柴瑞雪等[12]亦采用此方法科学筛选出干红葡萄酒的关键香气物质；由此可见，此方法可用于样品中关键香气物质的筛选。本研究采用GC-O并结合OAV筛选陇南3种具有代表性初榨橄榄油的关键香气成分。研究结果预期可为橄榄油风味品质改善及产业化技术改进提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用油橄榄均于2020年9月采自甘肃陇南市武都区祥宇油橄榄种植园（104.92°E，33.39°N）。选取该地经典的莱星和鄂植8号为研究对象，各采摘50 kg，鲜果经物理冷榨制备而成初榨橄榄油。此外，选取一种当地广受欢迎的市售特级混合初榨橄榄油（物理冷榨，田园品味牌，陇南田园油橄榄科技开发有限公司）进行对比分析。所有样品于4 ℃冷藏保存，且需在24 h内完成后续分析。

正构烷烃（C7～C40）、1,2-二氯苯、(Z)-2-戊烯-1-醇（≥96%）、1-辛烯-3-醇（≥98%）、己醇（≥99.9%）、3-己烯-1-醇（≥96.0%）、(E)-2-己烯-1-醇（96%）、芳樟醇（≥99.0%）、1-辛醇（≥99.7%）、庚醛（≥97.0%）、(E)-2-己烯醛（≥97.0%）、辛醛（≥98.0%）、壬醛（≥99.5%）、(E,E)-2,4-己二烯醛（≥95.0%）、(E)-2-辛烯醛（≥97.0%）、苯甲醛（≥99.5%）、(E)-2-癸烯醛（≥95.0%）、乙酸己酯（≥99.7%）、苯甲酸甲酯（≥99.5%）、2-辛酮（≥99.5%）、甲基庚烯酮（≥97.0%）、乙酸（≥99.8%） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S恒温磁力搅拌器 河南予华仪器有限公司；7890B-5977B GC-MS联用仪 美国Agilent公司；ME104E电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；9100嗅闻仪 瑞士Brechbuhler公司。

1.3 方法

1.3.1 固相微萃取处理

采用预先优化的固相微萃取条件进行样品前处理，准确称量5.00 g样品和1 μL 1,2-二氯苯（溶于甲醇的内标物，1.306 μg/μL）于20 mL顶空瓶中且用聚四氟乙烯/硅橡胶隔垫密封，在40 ℃平衡20 min，顺次将DVB/CAR/PDMS（50/30 µm）的萃取纤维头置于距离样品上表面1 cm处吸附30 min后，立即于GC进样口中在250 ℃热解吸5 min。

1.3.2 GC-MS条件

GC条件：采用前期预实验选择的DB-WAX柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；分离鉴定初榨橄榄油的挥发性成分，以1.5 mL/min流速的高纯氦气（＞99.999%）为载气，采用不分流进样模式，升温程序：40 ℃起始柱温保持1 min；以5 ℃/min升至75 ℃，保持5 min；然后柱温以3 ℃/min升至95 ℃，保持5 min；最后以10 ℃/min分别升至120、140 ℃及220 ℃并各保持5 min。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；全扫描模式；质量扫描范围m/z35～350。

1.3.3 定性及定量

定性方式：为了确保研究结果的准确性，采用3种方式对所测物质进行定性分析。首先，利用NIST14库进行初步定性（匹配度需大于80）；然后根据相同程序下正构烷烃的出峰时间计算各物质的Kováts保留指数（Kováts index，KI），按式（1）计算，将文献中的KI值与计算所得KI值进行比对定性；最后在相同程序下分离各物质的香气标准品，通过比对各物质与其相应标准品的出峰时间以实现准确定性。

式中：tx、tn及t（n+1）分别为物质x、碳原子数为n及碳原子数为n+1正构烷烃的保留时间/min。

定量分析：采用内标法进行定量，按式（2）计算：

式中：Cx为物质x的含量/（μg/kg）；Ax和As分别为物质x与内标物的峰面积；mx与ms分别为用于萃取的样品质量/kg与内标物质量/μg。

1.3.4 GC-O分析

通过嗅闻仪结合操作简单且应用广泛的频率检测法进行嗅闻分析，GC条件同GC-MS色谱条件。当组分在DB-WAX色谱柱上分离后，以1∶1模式分别进入质谱检测器和嗅闻仪。挑选具有丰富感官经验且经严格感官程序培训的8 位人员（4 男4 女，平均年龄25 岁）进行嗅闻分析。为了防止鼻腔黏膜受损，嗅闻口同时通入40 mL/min湿空气，要求所有人员在嗅闻过程中准确记录每个流出物开始和结束的感知时间及香气描述。最终以流出物被嗅闻到的总次数即检测频率（detection frequency，DF）作为量化指标，8 位评价人员中有4 位及以上人员感知到的香气物质视为香气活性物质。

1.3.5 OAV分析

OAV为香气物质质量浓度与风味阈值的比值，可用于评价香气物质对样品风味呈现的贡献程度[13]。通常OAV不小于1的香气物质具有不可忽视的贡献，OAV越大表明其贡献作用越大。

1.4 数据处理

以上所有实验皆作3次平行，以其平均值为最终结果。采用SPSS 23进行方差分析，Graphpad prism 8绘制物质含量堆积图。

2 结果与分析

2.1 初榨橄榄油GC-MS分析结果

采用GC-MS对比分析3种初榨橄榄油的挥发性组成，共鉴定出47种挥发性成分，包括19种醇、12种醛、6种酯、4种萜烯及6种其他类物质（表1）。其中，莱星、特级混合及鄂植8号初榨橄榄油各检测到35、30种及25种挥发性成分。对每类物质的总含量汇总分析发现（图1）3种初榨橄榄油皆富含醇类和醛类物质。从含量上看，己醇、3-己烯-1-醇、(E)-2-己烯-1-醇和(E)-2-己烯醛为主导，这与刘少敏[14]研究结果一致。有研究表明亚油酸和亚麻酸在脂肪氧合酶和氢过氧化物裂解酶的作用下裂解形成C6醛（(E)-2-己烯醛），然后这些醛类物质经乙醇脱氢酶作用转化形成醇类物质（己醇、3-己烯-1-醇）[15]。莱星初榨橄榄油中检测到较高含量的2-癸烯-1-醇（54.66 μg/10 g）、3-己烯醛（13.49 μg/10 g）和苯甲醛（1.80 μg/10 g）；庚醛、(E)-2-辛烯醛和罗勒烯等仅在特级混合初榨橄榄油中有检出；环戊醇、庚醇和(Z)-2-辛烯-1-醇等在鄂植8号初榨橄榄油中有检出。综上分析，3种橄榄油的挥发性成分的种类及物质含量具有明显区别。

图1 不同样本中各类物质总含量分析Fig.1 Total contents of different classes of volatile compounds in different virgin olive oil samples

表1 不同初榨橄榄油GC-MS结果分析Table 1 GC-MS analysis of volatile components of different virgin olive oil samples

续表1

2.2 初榨橄榄油的GC-O分析

由GC-O从3种初榨橄榄油中各筛选出13、15种和12种DF不小于4（检测总人数为8）的挥发性成分，这些物质称为香气活性化合物[16]，它们包括5种醇、6种醛、2种酯及3种其他物质（表2）。

表2 不同橄榄油GC-O筛选的香气活性化合物（DF≥4）Table 2 Aroma compounds identified by GC-O in different olive oil samples (DF ≥ 4)

经GC-O检测，共筛选出5种醇类物质，评价人员在所有样本中皆可以感知到这些物质。其中，己醇、3-己烯-1-醇及(E)-2-己烯-1-醇皆具有青草味，与本研究结果一致，这些物质皆是常见的具有青草特征的C6化合物，已多次在城固32号、皮瓜尔和佛奥[17-19]等橄榄油中检测到，对橄榄油风味轮廓呈现具有重要作用。1-辛烯-3-醇是具有典型蘑菇味的呈香物质，是山胡椒油、葱香油及大豆油[20-22]中重要风味化合物，本研究亦发现此物质是橄榄油中的香气活性化合物，尤其在鄂植8号橄榄油中，它的DF值达到最高（DF=8）。此外，具有橘子和柠檬味的芳樟醇在所有样品中皆具有高DF值，对橄榄油风味轮廓的形成具有不可忽视的作用。

醛类物质普遍具有强烈的气味特征，本研究通过GC-O共感知到6种醛类物质，分别为庚醛、3-己烯醛、(E)-2-己烯醛、辛醛、(E)-2-辛烯醛及(E,E)-2,4-癸二烯醛。其中，3-己烯醛和(E)-2-己烯醛具有青草气息，但3-己烯醛只在莱星橄榄油中有检出，(E)-2-己烯醛对橄榄油青草呈香属性的形成至关重要[23]，本研究亦发现此物质皆在所有橄榄油中有检出且具有较高的DF值。庚醛、(E)-2-辛烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛具有油脂的气味特征。通过GC-O筛选的2种酯类物质（乙酸己酯和苯甲酸甲酯）、1种萜烯类物质（α-蒎烯）、2-辛酮和乙酸为3种初榨橄榄油的重要香气物质。其中酯类物质主要具有果香特性。有研究表明萜烯类物质为植物的次生代谢产物，对特级初榨橄榄油风味识别至关重要，α-蒎烯作为一种萜烯类物质，对橄榄油风味品质具有较大贡献[14,24]，本研究发现具有松树气味特征的此物质在鄂植8号橄榄油中DF值为8，是重要的呈香物质。有研究报道乙酸对橄榄油整体风味具有负面影响[25]，乙酸具有酸味特征，它在所用样品中的DF值皆较小（DF≤5）。

2.3 香气活性化合物的OAV分析结果

香气阈值是呈香物质的一个重要特性，不同物质的香气阈值千差万别，即使相同物质在不同基质中其香气阈值也有所差异[26]，单纯依靠物质含量评测香气成分对样品呈香品质贡献具有局限性。因此，本研究在采用GC-O筛选出橄榄油香气活性物质的基础上，顺次结合可表征香气物质对呈香轮廓形成贡献性的物理量（OAV）深入揭示橄榄油的关键香气物质。一般，OAV不小于1的物质视作对样品香气品质具有贡献作用，其值越大表明贡献性越大[27]。由表3可知，莱星、特级混合初榨及鄂植8号橄榄油中分别有12、13种及11种OAV不小于1的香气成分，这些物质称为关键香气成分。其中，3种橄榄油中含有10种共有关键组分，包括醇类4种、醛类3种、酯类1种、α-蒎烯及乙酸。

表3 香气活性化合物的OAV分析Table 3 OAVs of aroma compounds

辛烯-3-醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛在所有样品中皆具有较高的OAV。其中，芳樟醇及(E,E)-2,4-癸二烯醛具有极低的香气阈值使其具有较高的OAV。相比之下，(E)-2-己烯醛的香气阈值较高，甚至达到320 μg/kg，但由于其含量较高，同样此物质对橄榄油呈香品质具有重要作用；Amanpour等[28]亦发现(E)-2-己烯醛不仅在Nizip Yaglik橄榄油中含量丰富，而且也是其关键香气物质之一。除以上物质外，所有橄榄油中OAV大于1的物质还有己醇、3-己烯-1-醇、辛醛、乙酸己酯、α-蒎烯及乙酸，它们对橄榄油呈香轮廓的形成也不可忽略。3-己烯醛只在莱星橄榄油中有检出，它的OAV达到793.52，是此样品中一种重要的香气物质。庚醛、反式-2-辛烯醛及2-辛酮只是特级混合初榨橄榄油中的关键香气成分（OAV≥1）。苯甲酸甲酯具有较高的阈值，因此对橄榄油香气品质贡献性较小。整个嗅闻过程中以空气为基质，通过评价人员实施感官嗅闻，可能具有些许人为误差；OAV分析绝大多数以载体油脂为基质测定的香气阈值，这种不同评测基质会引起两种方式鉴定结果出现不一致的情况[29]。但从整体上看，GC-O筛选结果与OAV分析结果大体一致，即通过GC-O筛选出的香气活性物质绝大多数为关键香气成分。因此，通过GC-O并结合OAV法最终科学筛选出不同橄榄油中关键香气成分。由图2A可以直观看出，莱星、特级及鄂植8号橄榄油各筛选出12、13种及11种关键香气成分，其中10种共有组分结构式见图2B，这些物质大多数为直链型，且多数含有C＝C及C＝O双键，这2种双键可能对橄榄油呈香品质具有重要作用。

图2 3种橄榄油关键香气成分的Venn图（A）及共有关键组分结构式图（B）Fig.2 Venn diagram (A) and structural formulae of key aroma compounds common to three olive oil samples (B)

3 结 论

通过对莱星、特级混合及鄂植8号3种初榨橄榄油进行GC-MS分析，共检测出47种挥发性成分，各自包括35、30种及25种物质。通过GC-O在3种橄榄油中各筛选出13、15种和12种香气活性成分，这些成分具有不同的呈香属性，其中C6醇和C6醛具有青草气息。顺次对香气活性物质进行OAV分析，3种橄榄油最终各筛选出12、13种及11种关键香气成分（OAV≥1），包含10种共有关键组分，1-辛烯-3-醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛的OAV较高，对3种橄榄油呈香品质发挥重要作用。本研究采用GC-O并结合OAV分析科学筛选出陇南3种橄榄油的关键香气成分，结果可为橄榄油品质改善及产业化技术改进提供科学依据。