基于非靶向代谢组学分析副干酪乳杆菌发酵枸杞汁各阶段代谢差异

胡明珍，刘慧燕，潘 琳，王 彤，李旭阳，王艳萍，方海田*

（宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室，宁夏 银川 750021）

宁夏枸杞（Lycium barbarumL.）是管状花目茄科枸杞属植物，耐寒及抗旱能力强，多生长于碱性沙质土壤，在我国主要分布于中北部地区。且宁夏枸杞是唯一载入2010年版《中国药典》的品种。其果实被称为枸杞子，又名枸杞豆、枸杞子等，是药食同源的植物资源[1-2]。枸杞果实中含有多种丰富的活性成分，具有降血糖、抗氧化、增强免疫力等作用[3-4]。由于枸杞本身并无特别突出的香味，以枸杞为原料生产的枸杞原浆风味欠佳，严重地影响了枸杞类饮品的生产和开发。

乳酸菌能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸[5]，可以通过对不同底物发酵而制作不同的发酵食品，如发酵乳制品、发酵肉制品、发酵蔬菜等[6]。相关研究表明，菌株在发酵过程中不仅能提高原料中不同营养物质的含量，还可以改善发酵制品的风味[7]。副干酪乳杆菌是一种广泛存在于发酵制品中的兼性厌氧微生物，有良好的调节肠道菌群[8]、抗氧化[9]和增强免疫力等功能[10]。用副干酪乳杆菌发酵果蔬产品，不仅能保留其原有的营养成分，还能提高有机酸、细菌素、多糖等多种活性成分的含量[11-12]。

代谢组学是基于不同生长环境、时期以及外界刺激下的生物样品中有机酸等低分子质量代谢产物为研究对象，通过高通量检测和数据处理，进行信息整合及生物标记物鉴定的科学[13]，已被广泛应用于食品研究中。张启力等[14]基于植物代谢组学技术从整体化学组成上分析了青海产区枸杞子的化学特征。杨孟可等[15]针对人工接种枸杞瘿螨，利用液相色谱-质谱联用技术比对分析枸杞瘿螨致瘿后枸杞叶片初生和次生代谢产物的变化。对枸杞发酵产品的研究多关注于枸杞中挥发性成分及其香气特征[16]，但运用代谢组学技术分析不同时期益生菌发酵枸杞代谢物组分及差异的报道很少。

本实验以宁夏枸杞为原料，采用从传统发酵浆水中分离出的1 株乳酸菌进行枸杞汁液态发酵，研究发酵液中代谢产物的变化。采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）非靶向代谢组学方法研究不同阶段枸杞发酵液中的代谢组分，结合多元统计分析方法筛选差异代谢物，分析相关的代谢通路，旨在为植物发酵过程中化学物质表征和功能成分研究提供有效研究策略。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宁夏甲级枸杞干果为宁夏中宁市售（2020年）；MRS（De Man Rogosa Sharpe）肉汤培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；水、甲醇（均为色谱级） 美国Fisher Chemical公司；甲氧胺盐酸盐上海阿达玛斯试剂有限公司；硅烷化试剂BSTFA（1%TMCS） 美国Regis Technologies公司；氯仿（色谱级） 上海沃凯化学试剂有限公司；D-异抗坏血酸钠（食品级）、果胶酶、过硫酸钾、乙醇、无水碳酸钠（均为分析纯） 银川伟博鑫生物科技有限公司。

采集甘肃陇南地区农家自然发酵浆水，通过纯培养技术筛选样品中的乳酸菌并保藏。由16S rDNA序列分析测定各菌株碱基序列，并与NCBI网站中的BLAST程序进行核酸序列的同源性比对，同源性均达到99%以上，确定分离菌种分别为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），并命名为副干酪乳杆菌NXU-19004，保藏于宁夏大学食品微生物应用技术与安全控制重点实验室。该菌株37 ℃培养14 h时达到稳定期，活菌数达1.24h108CFU/mL，pH 2条件下存活率达（87.35f0.43）%，耐受0.5%牛胆盐存活率达（65.68f2.86）%。

1.2 仪器与设备

BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司；LRH-250 生化培养箱 广东省医疗器械厂；静音真空高速破壁机 九阳股份有限公司；Wonbio-96c多样品冷冻研磨仪 上海万柏生物科技有限公司；NewClassic MS电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；高速冷冻离心机、手动单道移液器 德国Eppendorf公司；JXDC-20氮吹仪 上海净信实业发展有限公司；8890B-5977 GC-MS联用仪 美国Agilent公司；恒温振荡器 上海叶拓仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化与扩大培养

将保存于脱脂乳中的5 株乳酸菌分别划线接入MRS固体培养基上， 37 ℃恒温培养48 h后取出。挑取1 环固体培养基上生长较好的单菌落接种至MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养24 h后取出，并按照2%接种量（体积分数）将菌液接入液体培养基中进行扩大培养（37 ℃，24 h），在充分活化两代后将菌液离心（4 ℃，3 000 r/min，5 min），倾去培养基，用无菌水洗涤沉淀2次后得到菌泥，再将其转入无菌水中振荡均匀，活菌数可达106CFU/mL以上，得到菌悬液放入4 ℃冰箱备用。

1.3.2 发酵枸杞汁的制备

挑选肉厚、无腐烂的宁夏枸杞干果，用流动水多次冲洗枸杞表皮，洗掉黏在枸杞表面的污垢后，以纯水与枸杞干果5∶1（mL/g）加水，并加入0.05%的异抗坏血酸钠护色后，室温浸泡8～9 h。再加入0.15%的果胶酶后打浆，用3 层无菌纱布和漏斗过滤除籽。加入5%白砂糖后，添加10%的柠檬酸调pH值至4.5，分装于玻璃瓶中，每瓶100 mL，用纱布球和报纸封口，在55 ℃条件下杀菌25 min后备用。将灭菌后的枸杞汁取出，冷却后接入培养好的菌株，接种量为5%，静置于37 ℃条件下发酵14 h，得到成品。

1.3.3 样品制备与处理

以发酵后样品中乳酸产量为评价指标，对接种副干酪乳杆菌NXU-19004的枸杞发酵液每间隔2 h进行取样，分别选取灭菌后未接入菌液的枸杞汁、接菌发酵0 h、接菌发酵10 h和接菌发酵22 h的枸杞发酵液，共4 组待测样本。同时制备了质控样品（由每个分析样品各取部分混合而成），通过GC-MS联用进行代谢组学分析。

发酵样品前处理：取发酵液于10 mL离心管中，涡旋振荡混匀后，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。取1 000 μL样品加入800 μL乙酸乙酯，涡旋30 s混匀后，冰水浴超声萃取30 min。将样品于-20 ℃静置30 min，然后4 ℃、13 000hg离心15 min，取上清液，装入1.5 mL离心管中；再加入700 μL乙酸乙酯重复萃取一次，合并两次上清液氮气吹干，加入200 μL乙酸乙酯复溶，涡旋2 min后，冰水浴超声10 min，4 ℃、13 000hg离心10 min。取上清液至进样小瓶中进行GC-MS代谢组学分析。

1.3.4 GC-MS分析

色谱条件：样本用不分流模式注入GC-MS系统进行分析，进样量1 μL。样品经Agilent 122-5532G DB-5MS毛细管柱（40 mh0.25 mm，0.25 μm）分离后进入质谱检测。进样口温度260 ℃，载气为高纯氦气，载气流速1 mL/min，隔垫吹扫流速3 mL/min，溶剂延迟5.5 min。升温程序：初始温度60 ℃，平衡0.5 min，然后以8 ℃/min的速度升至310 ℃，并维持6 min。

质谱条件：电子电离源，传输线温度310 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV。扫描方式为全扫描模式（SCAN），质量扫描范围m/z50～500，扫描频率为3.2 scan/s。

1.4 数据处理

所有的GC-MS图谱使用MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）软件进行峰提取、对齐等数据预处理操作，并将得到的数据输入ropls（Version1.6.2）软件，使用R2和Q2进行主成分分析（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），根据Studentt检验的P值小于0.05，同时PLS-DA模型PC的计算变量投影重要性分析值（variable importance in the projection，VIP）＞1，进行差异性代谢物的筛选。对筛选出的差异代谢集，通过关联分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路数据库通路分析、聚类分析等高级分析手段进行生物学信息挖掘。

2 结果与分析

2.1 不同阶段枸杞发酵液代谢物PCA

采用PCA对优化条件下，从未接菌枸杞汁、接菌发酵0 h、接菌发酵10 h和接菌发酵22 h的4个不同时间段的枸杞发酵液进行差异分析，从总体上反应了各组样本之间的总体差异和组内样本之间的变异度大小。样本通过降维分析后，在PC1、PC2上有相对坐标点，各个坐标点距离代表了样本间聚集和离散程度；置信椭圆表示本组“真实”样本在95%置信度下，分布在此区域内；超过此区域可认为是可能异常样本。如图1所示，4 组发酵液样品以及质控样品样本组的平行样本聚在一起，表明所有检测具有良好的分析稳定性和实验重现性；同时，PC1和PC2贡献率分别为53.80%和19.60%，两者累计贡献率达到73.40%，可见各时间内枸杞发酵液之间分离趋势较明显，从整体上反映出这些样品之间的代谢物差异。

图1 不同阶段枸杞发酵液样本PCA模型得分图Fig.1 PCA score plot of fermented goji juice samples at different fermentation times

2.2 不同阶段枸杞发酵液代谢物PLS-DA

PLS-DA通过对PC适当旋转，可以有效对组间观察值进行区分，并且能够找到导致组间区别的影响变量[17]。常用来直观地展示模型的分类效果，图中两组样品分离程度越大，说明分类效果越显著。进一步采用PLS-DA对构建的模型进行验证，4个时间点内枸杞发酵液样本PLS-DA得分图和置换检验结果如图2所示，其结果与PCA相似，正离子模式下所建模型对发酵液的累计判别解释能力R2X=0.884，R2Y=0.985，对模型预测能力Q2=0.949，这3个指标越接近于1时表示模型越稳定可靠，模型的拟合度较好。同时采用n=200的随机置换检验（图3），可见模型随着置换保留度下降，R2和Q2下降，回归线呈向上的趋势，且位于最右边的R2和Q2值均超过0.9，Q2回归线的截距为-1.007 9，说明置换检验过关，模型不存在过拟合现象，具有很好的稳定性和预测性，适合探索接种乳酸菌后枸杞汁发酵过程中的代谢物差异。

图2 不同阶段枸杞发酵液样本PLS-DA得分图Fig.2 PLS-DA score plot of goji juice fermented for different times

图3 不同阶段枸杞发酵液样本置换检验图Fig.3 Permutation test of giji juice fermented for different times

2.3 差异代谢物的筛选与分析

根据PLS-DA模型结果，将t检验P值小于0.05的代谢物作为筛选标准。结合METLIN、HMDB等在线数据库通过化合物的精确m/z和保留时间进行代谢物的鉴定，结果如表1所示，从4个阶段的枸杞发酵液中共筛选出14 大类63种差异代谢物，差异代谢物的种类由多到少为有机酸及其取代衍生物、氨基酸及其衍生物、羧酸及其衍生物、脂肪酰基、类黄酮、呋喃、咪唑嘧啶、吲哚及其衍生物、非金属氧阴离子化合物、酚酸类、三萜类、吡啶及其衍生物等。

表1 不同阶段枸杞发酵液中差异代谢物含量Table 1 Contents of differential metabolites in goji juice fermented for different times

有机酸类在枸杞发酵液中不仅具有呈香作用，同时也可在发酵过程中抑制杂菌。枸杞发酵液中的有机酸一部分来源于发酵前酸度调节，另一部分来源于乳酸菌发酵过程中微生物代谢产生。如苯甲酸和苯甲醛等可用作果汁饮料的定香剂和香料[18]，也可用以调和香精以及香料的制备。但也有一些产生不良风味的物质，如硫氰酸苄酯[19]，从未接菌到接种乳酸菌发酵22 h过程中，其平均相对丰度随时间的延长而降低，且在所有差异代谢物中含量最高。游离氨基酸是菌株代谢过程中生成的重要组分，一些游离氨基酸不仅具有生物活性[20]，还具有鲜、甜、苦、涩、酸等特殊滋味[21]。从4个阶段枸杞发酵液中筛选出的氨基酸差异代谢物有脯氨酸、N-甲基丙氨酸、肌氨酸、丙氨酸，均属于甜味氨基酸，在接种发酵过程中其平均相对丰度均呈上升趋势，可改善枸杞经乳酸菌发酵产生的有机酸的酸味，对枸杞汁的发酵风味及感官品质的形成具有重要贡献。黄酮类化合物广泛分布于豆科植物中，能带给发酵产品愉快的香气[22]，主要为3-羟基黄酮。差异代谢物中以角鲨烯为主的三萜类物质不仅具有生理调控功能[23]，还具有防御功能[24]。

续表1

2.4 差异代谢物的聚类分析

代谢物分布可在视觉上分为上调和下调[25]。为了直观观察不同发酵阶段差异代谢物的浓度变化趋势，依据每个差异代谢物的相对含量作出热图（选取代谢物含量较高的前35个物质），如图4所示，根据上方样本聚类的树状图，可以分成两个区域，发酵22 h的6个平行样本为第1区域，未发酵、发酵0 h和发酵10 h为第2区域，可见发酵22 h后的代谢物颜色比其他3个阶段深，而这3 组中发酵10 h后的代谢物丰度又远超过其他两组，可见两个样本分支离的越近，说明这两个样本所有代谢物的表达模式越接近，即代谢物表达量变化趋势越接近。从最左图中可以看出发酵组（FGJF_22h）高含量差异代谢物超过50%，明显多于对照组（UFGJ2），其中发酵组中的有机酸及其取代衍生物、氨基酸及其衍生物含量均高于未发酵组，其他类代谢物在两组中的含量差别不明显。同时，在鉴定出的63种差异性代谢物中，烟酸、肌氨酸在发酵22 h后表达量低于未发酵的枸杞汁。烟酸是人体必需的13种维生素之一，参与人体的脂质代谢、氧化过程和无氧分解过程[26]。肌氨酸在肌肉中以磷酸肌酸的形式存在，可促进ATP的合成[27]。其通过层次聚类分析可以看出，不同发酵阶段对枸杞汁中各类代谢物的含量具有显著影响，通过比较差异代谢物含量的异同，对鉴别经乳酸菌发酵后枸杞汁中的代谢产物具有一定的参考意义。

图4 不同阶段枸杞发酵液差异代谢物层次聚类热图Fig.4 Hierarchical clustering heat map of differential metabolites in goji juice fermented for different times

2.5 差异代谢物的代谢通路分析

植物在生长过程中是一个十分复杂的代谢过程，受多种物质和反应共同调控[28]，并不能仅仅从某一种物质含量的高低进行整体判断，因此需进一步对其代谢通路进行分析。通过与KEGG数据库比对，可将基因按照参与通路或行使功能进行分类，可以获知代谢物参与的代谢通路信息，从而评价其对生物新陈代谢过程的影响。4个不同阶段的枸杞发酵液中共检索到差异代谢物参与的47 条代谢通路，KEGG二级分类名称分别为氨基酸代谢、其他次生代谢产物的生物合成、氧化磷酸化、聚糖生物合成与代谢、脂质代谢、辅助因子和维生素的代谢、其他氨基酸代谢、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢、外源生物降解与代谢、碳代谢等。

将上述筛选鉴定的差异代谢物匹配信息后，利用对应物种的通路数据库对其进行富集分析和拓扑结构分析，根据代谢通路的浓缩，识别出可能的受生物扰动的代谢通路[29]。首先，对差异代谢物和通路进行相关性分析，得到多条相关代谢通路。再根据P值和Impact值综合分析，筛选出最为显著的具体关键代谢通路有9 条，结果如表2所示。针对枸杞益生菌发酵过程中差异组分进行KEGG富集分析，分析发酵阶段对益生菌发酵枸杞过程中代谢通路分析的影响，结果以气泡图的形式展现（图5）。气泡代表KEGG代谢通路，气泡所在横坐标和气泡大小表示影响值，气泡越大，表示通路重要性越大；纵坐标和气泡颜色表示富集分析的P值（取负常用对数，即-lgP），颜色越深P值越小，富集程度越显著。由图5可知，既有合成途径也有降解途径，其中丙氨酸代谢处的气泡颜色最深、气泡相对较大，说明随着发酵时间的延长，对乳酸菌发酵枸杞代谢中氨基酸类物质的影响最显著。

表2 不同阶段枸杞发酵液中代谢通路分析Table 2 Metabolic pathway analysis of goji juice fermented for different times

图5 不同阶段枸杞发酵液差异组分代谢通路影响因子图Fig.5 Analysis of factors influencing the metabolic pathways of differential metabolites in goji juice fermented for different times

其次，通过KEGG等权威代谢物数据库对差异代谢物进行映射，反映出具有极显著差异的物质有10个，分别为丙氨酸、柠檬烯、苯甲醛、苯甲酸、烟酰胺、烟酸、角鲨烯、脯氨酸、肌氨酸、2-苯基乙酰胺。为了更直观地了解关键代谢物，使用箱形图比较来自4个不同阶段枸杞发酵液中这10种物质的含量丰度差异（图6）。其中丙氨酸、脯氨酸和肌氨酸主要参与氨基酸代谢，并且丙氨酸又参与氨酰tRNA生物合成途径。氨基酸的代谢主要是由于菌株基于枸杞汁的代谢利用所导致，这些氨基酸为发酵枸杞汁提供了主要的风味。烟酰胺和烟酸主要参与辅助因子和维生素的代谢。而苯甲醛、苯甲酸主要为一些外源生物降解和代谢，二者同时参与氨基苯甲酸降解途径和甲酸降解途径，而苯甲酸又在苯丙氨酸代谢途径中发挥作用；角鲨烯主要参与脂质代谢，是一种无毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物质，具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化、减缓皮肤老化、增强机体免疫力等多种功效[30]；其他物质主要参与其他次生代谢产物的生物合成。同一代谢物同时参与了多条代谢通路，说明该差异代谢物对通路具有较大的影响。可见随着发酵过程中营养物质的减少以及pH值的下降，各级代谢趋于稳定，代谢物也在不同的发酵时间之存在明显差异。

图6 不同阶段枸杞发酵液中10种关键代谢物的相对丰度Fig.6 Relative abundance of 10 key metabolites in goji fermented for different times

3 结 论

基于GC-MS的非靶向代谢组学技术，从未发酵、接菌发酵0 h、接菌发酵10 h和接菌发酵22 h的4种枸杞发酵液中鉴定分析出63种差异代谢产物。通过对差异代谢物和通路进行相关性分析，筛选出了9 条最为显著的关键代谢通路，映射出丙氨酸、脯氨酸、肌氨酸、2-苯基乙酰胺、柠檬烯、苯甲醛、苯甲酸、烟酰胺、烟酸、角鲨烯为关键代谢物。枸杞发酵液的差异代谢物中参与脂肪代谢途径的有1种，参与辅助因子和维生素的代谢的有2种，参与外源生物降解和代谢的2种，而有参与氨基酸代谢的有3种，可见不同发酵阶段可以调节枸杞中氨基酸类物质的代谢，显著影响枸杞发酵产品特殊风味物质的形成。并且发现了具有增强机体免疫能力、抗衰老、抗肿瘤等多种生理功能的活性物质角鲨烯。该模型的建立可以有效对发酵过程中氨基酸、有机酸、糖类等生物活性物质含量变化进行区分，有助于探究外源添加物对枸杞的增效作用。同时为不同阶段益生菌发酵产品建立了有效的评价方法，也为开发富含活菌和多种活性成分的枸杞发酵产品提供一定的理论参考。