基于网络药理学探索黄连解毒汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制

邢丽颖 白兴龙 尚 可 吕小燕

作者单位：1.山西中医药大学研究生学院，太原 030000；2.山西省中医院脾胃科，太原 030000

溃疡性结肠炎（UC）主要临床表现为反复发作的腹泻、腹痛和黏液脓血便，其发病机制目前尚未明确，病变主要限于大肠黏膜与黏膜下层[1]。针对UC 治疗，目前临床多采用糖皮质激素、氨基水杨酸类药物、免疫抑制剂和生物制剂治疗，严重者甚至进行手术切除。并且UC 病情的严重程度和高复发率[2]给患者及家属带来了沉重的心身负担。

黄连解毒汤名见《外台秘要》，由黄芩、黄连、黄柏、栀子4 味中药组成。药理学研究表示黄连解毒汤不仅有抗菌、抗炎、抗氧化作用，还可以调节肠道菌群及免疫功能，同时具有保护胃肠黏膜作用[3-4]。目前，临床上很多医家用黄连解毒汤治疗UC 效果显著，例如靳瑾和周知然[5]通过研究表明黄连解毒汤可以显著改善UC 患者的肠道菌群失调，但其作用机制尚未明确。本研究将通过网络药理学方法对黄连解毒汤治疗UC 多成分、多靶点和多通路进行挖掘，最后分析其潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 黄连解毒汤有效成分的筛选和靶点预测

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）分别对黄连解毒汤中黄芩、黄连、黄柏、栀子有效成分进行检索，以口服生物利用度（OB）＞30%和类药性（DL）＞0.18 为条件，筛选其有效成分及所对应的预测靶点。

1.2 UC 作用靶点检索

以“ulcerative colitis”为关键词分别检索GeneCards 与0MIM 数据库，获取UC 的作用靶点，去除假阳性并去重后，即为UC 的作用靶点。

1.3 “黄连解毒汤-药物成分-关键作用靶点-UC”网络构建

将UC 作用的靶点和黄连解毒汤各药物有效成分对应的靶点一起筛选出共同靶点并制作韦恩图。将黄连解毒汤中主要有效成分、主要有效成分与治疗UC 的关键作用靶点、关键作用靶点与UC 的对应关系导入到Cytoscape，建立“中药-成分-靶点-疾病”网络。

1.4 构建靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络

将UC 关键作用靶点导入String 数据库，选择物种为people，以最低要求互动得分0.9 为筛选参数，得到黄连解毒汤治疗UC 的PPI 网络。

1.5 基因本体GO 富集分析与京都基因和基因组百科全书KEGG 通路富集分析

利用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.Gov/）对潜在靶点进行GO 功能富集分析，研究黄连解毒汤治疗UC 生物功能；KEGG 通路富集分析潜在靶点的相关通路，研究黄连解毒汤治疗UC 的主要信号通路。

2 结果

2.1 黄连解毒汤有效成分与靶基因

最终得到黄连解毒汤的有效成分共84 个，其中黄芩36 个，黄柏37 个，黄连14 个，栀子15 个。分别得到靶基因黄芩507 个、黄柏510 个、黄连287 个、栀子363 个。

2.2 UC 相关靶点筛选结果

最终共筛选出4 622 个UC 相关基因。将UC 相关基因与黄连解毒汤靶点基因取交集，共获得142 个关键靶点基因。见图1。

图1 UC 相关靶点韦恩图

2.3 “黄连解毒汤-药物成分-关键作用靶点-UC”网络构建

将黄连解毒汤中主要有效成分、主要有效成分与治疗UC 的关键作用靶点、关键作用靶点与UC 的对应关系导入到Cytoscape，建立“黄连解毒汤-药物成分-关键作用靶点-UC”网络。其中红色为UC，深蓝色为黄连解毒汤，绿色为黄连解毒汤主要化学成分，浅蓝色为关键作用靶点。结果显示quercetin（槲皮素）、wogonin（汉黄芩素）、kaempferol（山奈素）、beta-sitosterol（β 谷固醇）、coptisine（黄连碱）、Stigmasterol（豆甾醇）等化合物在整个网络中发挥着重要作用。见图2。

图2 “黄连解毒汤-药物成分-关键作用靶点-UC”网络

2.4 核心靶点PPI 网络的构建

将142 个共同靶点导入String 数据库，得到PPI网络构建一共128 个节点，535 条边。见图3。再利用R 软件计算各基因靶点Degree，同时制作核心靶点柱状图，其中排名前6 个靶点分别是JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14。Degree 值分别为35、32、31、30、24、24。见图4。

图3 核心靶点PPI 网络

图4 核心靶点PPI 网络节点度值排序

2.5 GO 功能富集分析结果

运用DAVID 数据库对黄连解毒汤治疗UC 的靶点进行GO 富集分析，共富集148 个生物学过程和功能。GO 富集分析分为生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。BP 主要涉及对脂多糖、无机物质的反应及凋亡信号通路、应对受伤、细胞对脂质的反应、对外来生物刺激的反应、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合、细胞死亡的正向调控等方面。CC 主要涉及膜筏、囊腔、转录调节复合物、质膜蛋白复合物、细胞外基质、细胞质的核周区等方面。MF 主要涉及DNA 结合转录因子结合、蛋白激酶绑定、核受体的活性、细胞因子受体结合、蛋白质结构域特异性结合、血红素结合等方面。根据校正后P值进行排序，选择前20 个进行条形图展示。黄连解毒汤治疗UC 主要通过影响机体DNA 结合转录因子结合、细胞因子受体结合、受体配体活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合、信号受体激活剂活性等发挥作用。见图5。

图5 GO 分析结果柱状图

2.6 KEGG 通路富集分析结果

KEGG 通路富集分析结果一共得到161 条信号通路，根据P值排序，列出前20 位条目。通过富集结果得到黄连解毒汤治疗UC 涉及AGE-RAGE 信号通路、乙型病毒性肝炎、IL-17 信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、流体剪切应力和动脉粥样硬化、丙型病毒性肝炎等信号通路。见图6。

图6 KEGG 信号通路点状图

3 讨论

本研究通过网络药理学方法构建了中药-成分-靶点-疾病网络，对黄连解毒汤治疗UC 的潜在作用机制进行分析，一共得到84 个有效成分，142 个关键作用靶点，共富集148 个生物学过程和功能、161 条信号通路。

在筛选出的黄连解毒汤84 个有效成分中，槲皮素、山奈素、β 谷固醇、黄连碱、豆甾醇、汉黄芩素等化合物在整个药物调控网络中发挥着重要作用。通过现代药理学研究表明槲皮素可有效减少炎症介质TNF-α、IL-1β 以及IL-6[6]；同时可以提高肠道有益菌群数，降低有害菌群数，改善肠道菌群失调[7-8]。黄连碱可通过阻断核因子κB信号通路来释放炎症介质，达到抗炎的效果[9]。豆甾醇可以有效减少粪便中的血红素水平，同时也可缓解肠道组织炎症介质IL-1β、IL-6、MCP-1 和环氧合酶-2（COX-2）的mRNA表达[10]。汉黄芩素可通过增强Teff 细胞功能、抑制Treg 细胞功能来改善肠道炎症[11]。

依据PPI 网络分析，黄连解毒汤治疗UC 涉及的关键靶标有JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK14。Zhu 等[12]发现通过对RNF8 介导AKT1 泛素化，进而抑制AKT/mTOR 信号通路，最终对UC起一定的保护作用。并且AKT1 是miR-885-3p 调节结直肠癌细胞的功能性靶基因[13]。miR-145 通过靶向MAPK 来抑制大肠癌中的细胞增殖[14-15]。IL-6 是一种机体重要的细胞因子，通过JAK/STAT3 信号通路发挥作用，可广泛参与人体炎症反应、免疫调节、细胞凋亡过程及增殖过程。典型的炎症介质IL-6 通过gp130 蛋白发送信号，gp130 的激活可导致信号转导和转录激活因子-3（STAT3）的激活，由此STAT3进入细胞核并促进靶基因的转录，其中包括IL-6 水平升高[16]。IL-6 在UC 患者免疫调节系统中发挥着不可替代的作用[17]。

本研究通过KEGG 通路富集分析发现，黄连解毒汤治疗UC 的信号通络主要与AGE-RAGE 信号通路、乙型病毒性肝炎、IL-17 信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、流体剪切应力和动脉粥样硬化、丙型病毒性肝炎信号通路有关。RAGE 可诱导炎症介质释放，最终参与炎症反应，RAGE 在UC 病变黏膜中呈高表达[18]。并且国外已有人建议RAGE 启动子的甲基化和RAGE 启动子基因型可以共同作为临床生物标志物，以帮助进行UC 风险评估[19]。IL-17 信号通路的主要因子IL-17有强烈的致炎性，与UC 发病密切相关[20]，国外相关文献[21]已证明IL-23 对T 细胞介导的肠炎是不可少的，它主要通过IL-17 与IL-6 促进炎症反应。研究证实抗IL-17 治疗可以有效缓解肠道炎症[22-23]。

综上所述，通过运用中药网络药理学方法，发现黄连解毒汤治疗UC 的可能潜在有效成分是槲皮素、黄连碱、豆甾醇、汉黄芩素等，关键基因是AKT1、MAPK1、IL-6 等，通过AGE-RAGE 信号通路、IL-17信号通路等来抑制炎症，从而起到治疗UC 的作用。但本研究仍存在一定的局限性，由于平台数据及有关软件功能和算法的限制，为了明确黄连解毒汤治疗UC 的复杂过程和作用机制，仍需进行进一步实验研究加以论证。