T淋巴细胞亚群和细胞因子与耐药型癫痫患者认知功能的相关性分析

杜欣，王冰冰，来青伟，李青云，李昕昱，胡朋，王恒，樊红彬

癫痫是由多种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电所致的临床综合征，临床表现具有发作性、短暂性、重复性、刻板性的特点。大约80%的癫痫患者可通过抗癫痫药物控制其病情，但仍有一些癫痫患者对药物治疗没有足够的反应，它们被归类为耐药型癫痫(DRE)[1]。大约70%～80%的癫痫患者会出现认知衰退[2]。认知障碍包括记忆障碍、注意力障碍、执行功能障碍。DRE患者的药物反应性差，发作频率高，从而导致脑损伤，并可能导致显著的认知损害[3]。焦虑和抑郁是DRE患者常见的精神合并症[4-5]。DRE患者合并的认知及情绪损伤进展迅速且程度严重，严重影响患者的生活质量，造成巨大的社会和个人负担，故预防和治疗癫痫认知及情绪损伤具有重要的临床意义。

癫痫的发病机制尚未明确，越来越多的证据[6-8]表明，免疫异常可能对癫痫病灶的形成和癫痫的持续复发至关重要。在多种认知障碍疾病中，免疫紊乱参与认知及情绪损伤的发生[9-10]，但癫痫领域尚缺乏相关报道。本研究通过对癫痫患者进行T淋巴细胞亚群、细胞因子水平测量及成套神经心理学测试，观察免疫炎症指标对癫痫合并认知及情绪损伤的影响，并进一步探讨其机制。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2020年11月至2021年7月至徐州医科大学附属医院神经内科就诊的58例癫痫患者，并根据治疗反应和国际抗癫痫联盟建议分为药物敏感型癫痫(DSE)组和DRE组。DSE被定义为合理应用抗癫痫药物治疗，至少≥1年无癫痫发作者，而DRE被定义为在足量、足疗程合理应用2种或2种以上抗癫痫药物治疗后发作仍未能得到控制者。纳入标准：(1)通过临床表现、药物反应情况、EEG或头颅MRI结果，对照2017年国际抗癫痫联盟(ILAE)定义的DRE和DSE标准明确诊断；(2)配合神经心理学检查；(3)知情并同意本研究。排除标准：(1)有对认知有显著影响的其他慢性疾病；(2)72 h内有癫痫发作；(3)脑内除癫痫外存在其他神经精神等器质性疾病；(4)有长期酗酒或精神活性物质滥用史；(5)6个月内使用激素及其他免疫抑制剂；(6)伴有其他自身免疫性、肿瘤或炎性疾病；(7)不能配合神经心理学检测。另外选取同期年龄、性别、受教育程度等与癫痫患者无统计学差异的我院健康体检者30名作为健康对照组。本研究通过徐州医科大学附属医院伦理委员会批准(XYFY2021-KL055)，所有受试者事先知晓研究目的并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料采集 对所有患者均进行详细的病史采集，包括姓名、性别、年龄、教育程度、首发年龄、病程、发作类型、服用抗癫痫药物、头部影像学、EEG等。

1.2.2 外周血T淋巴细胞亚群及细胞因子检测方法 采集研究对象静脉全血2 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝备用。流式细胞仪(南京思创流式细胞仪Navios，10 Color)检测辅助T淋巴细胞CD3+CD4+T淋巴细胞百分比，抑制T淋巴细胞CD3+CD8+T淋巴细胞百分比。多重微球流式免疫荧光发光法检测IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-α、IFN-y和TNF-α水平，严格按照试剂盒操作(青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司)。

1.2.3 神经心理学量表检查 对所有研究对象行神经心理学量表评估。焦虑/抑郁情绪采用焦虑自评量表(SAS)和抑郁自评量表(SDS)进行评测。认知功能：(1)整体智能：蒙特利尔认知评估量表(MoCA)；(2)记忆功能：临床记忆量表(MQ)；(3)注意力及执行功能：数字符号转换测验；Stroop字色干扰实验。

2 结 果

2.1 各组一般资料的比较 见表1。各组患者性别、教育程度等一般资料差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。

表1 各组患者一般资料比较[ x±s,例(%)]指标健康对照组(n=30)DSE组(n=32)DRE组(n=26)F/χ2值P值性别(男)15(50.0)18(56.3)15(57.7)0.3910.822年龄(岁)33.33±11.2533.94±18.6130.08±11.030.5820.561教育程度1.5650.815 小学及以下11(36.7)10(31.3)7(26.9) 初中/中专8(26.7)11(34.4)11(42.3) 高中及以上11(36.6)11(34.4)8(30.8)

2.2 DRE组与DSE组患者临床资料的比较 DRE组患者26例，男性14例，女性12例；起病年龄(21.1±12.2)岁；病程(9.1±8.7)年；局灶性发作12例，全面性发作14例；影像学异常10例，包括海马硬化2例、海马萎缩4例、海马沟残余囊肿1例、皮质发育不良3例；26例患者全部为联合用药治疗。DSE组患者32例，男性18例，女性14例；起病年龄(28.1±21.1)岁；病程(5.8±7.5)年；局灶性发作15例，全面性发作17例；影像学异常4例，包括海马萎缩1例，海马软化灶1例，额颞叶萎缩1例，额颞叶软化灶1例；单药治疗28例，联合用药治疗4例。

2.3 各组间T淋巴细胞亚群及细胞因子水平比较 见表2。单因素方差分析结果显示，各组患者CD4+、CD8+水平差异均有统计学意义(均P<0.05)。进一步采用LSD法对各组间CD4+、CD8+水平进行两两比较结果显示，DRE组患者CD4+、CD8+水平均明显低于健康对照组及DSE组患者，DSE组患者CD4+、CD8+水平均明显低于健康对照组(均P<0.05)。Kruskal-WallisH检验结果显示，各组患者IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-α、IFN-y水平差异均无统计学意义(均P>0.05)，各组患者IL-1β、IL-6、TNF-α水平差异均有统计学意义(均P<0.05)；进一步采用Nemenyi法对各组间IL-1β、IL-6、TNF-α水平进行两两比较结果显示，DRE组患者IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显高于健康对照组及DSE组患者，DSE组患者IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显高于健康对照组(均P<0.05)。

2.4 各组间认知功能及情绪特点比较 见表3。各组患者MoCA、MQ、数字符号测试得分经单因素方差分析结果显示，差异均有统计学意义(均P<0.05)；进一步采用LSD法对各组间MoCA、MQ、数字符号测试得分进行两两比较结果显示，DRE组患者MoCA、MQ、数字符号测试得分均明显低于健康对照组及DSE组患者，DSE组患者MoCA、MQ、数字符号测试得分均明显低于健康对照组(均P<0.05)。各组患者Stroop测试(点、字、色)、SAS、SDS得分经Kruskal-WallisH检验结果显示，Stroop测试(点、字)差异均无统计学意义(P>0.05)，Stroop测试(色)、SAS、SDS差异均有统计学意义(均P<0.05)；进一步采用Nemenyi法对各组间Stroop测试(色)、SAS、SDS进行两两比较结果显示，DRE组患者SAS、SDS均明显高于健康对照组及DSE组患者，DSE组患者SAS、SDS均明显高于健康对照组，DRE组患者Stroop测试(色)明显低于健康对照及DSE组患者，DSE组患者Stroop测试(色)明显低于健康对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.5 DSE组患者情绪及认知功能损伤与免疫指标的相关性 见表4。DSE组患者MoCA、MQ、数字符号、Stroop(色)、SAS、SDS与CD4+、CD8+、IL-1β、IL-6、TNF-α之间的相关性经Spearman相关性分析结果显示，各指标间的相关性均无统计学意义(均P>0.05)。

2.6 DRE组患者情绪及认知功能损伤与免疫指标的相关性分析 见表5。DRE组患者MoCA、MQ、数字符号、Stroop(色)、SAS、SDS与CD4+、CD8+、IL-1β、IL-6、TNF-α之间的相关性经Spearman相关性分析结果显示，CD4+与MoCA、MQ、数字符号、Stroop(色)之间均存在明显的正相关(均P<0.05)；IL-1β、IL-6、TNF-α与MoCA、MQ之间均存在明显的负相关(均P<0.05)；IL-1β、IL-6、TNF-α与SDS之间均存在明显的正相关(均P<0.05)；其余各指标间的相关性均无统计学意义(均P>0.05)。

表2 各组间T淋巴细胞亚群及细胞因子水平的比较[ x±s,M(Q25,Q75)]项目健康对照组(n=30)DSE组(n=32)DRE组(n=26)F/χ2值P值CD4+42.00±5.8736.54±7.57△32.18±8.37△▲12.779<0.001CD8+32.65±5.7626.95±7.84△22.94±3.81△▲17.675<0.001IL-1β3.03(2.25,3.83)3.57(3.56,9.42)△11.71(4.33,16.23)△▲22.171<0.001IL-21.54(0.81,1.63)1.26(0.71,2.25)1.38(0.77,2.22)0.3930.822IL-41.27(0.66,1.32)1.32(0.83,1.41)1.31(0.73,1.41)1.6040.448IL-52.10(1.96,5.46)2.05(1.01,4.23)2.54(1.40,4.19)2.2960.317IL-61.91(1.35,2.54)3.53(2.03,5.83)△7.29(3.33,12.91)△▲24.553<0.001IL-82.66(2.43,5.13)2.41(1.28,5.51)2.79(2.21,4.89)3.1300.209IL-101.07(0.84,1.29)0.97(0.82,1.33)1.13(0.90,1.56)2.1590.340IL-12p701.33(1.10,1.65)1.26(0.95,1.92)1.43(0.97,2.02)0.2430.886IL-171.18(1.03,2.03)1.19(1.04,1.96)1.27(1.05,2.04)0.2250.893IFN-α1.13(0.89,2.05)0.88(0.67,1.51)1.21(0.84,1.99)3.7040.157IFN-y4.00(3.08,7.07)5.91(3.40,11.21)4.15(2.75,7.80)3.2710.195TNF-α1.42(0.87,1.90)1.96(1.33,3.73)△4.36(1.86,9.62)△▲23.171<0.001 注:与健康对照组比较△P<0.05;与DSE组比较▲P<0.05

表3 各组间认知功能及情绪特点的比较[ x±s,M(Q25,Q75)]项目健康对照组(n=30)DSE组(n=32)DRE组(n=26)F/χ2值P值MoCA27.17±1.5624.16±5.04△21.35±4.35△▲15.137<0.001MQ92.33±6.5782.56±17.59△72.98±12.57△▲15.025<0.001数字符号测试40.23±9.3729.97±18.08△19.35±13.98△▲14.723<0.001Stroop测试 点24.0(24.0,24.0)24.0(24.0,24.0)24.0(21.5,24.0)3.8260.148 字24.0(23.8,24.0)24.0(24.0,24.0)24.0(23.5,24.0)1.2850.526 色23.5(21.8,24.0)21.0(13.0,24.0)△12.0(8.0,21.2)△▲19.903<0.001SAS27.5(25.0,30.0)37.5(28.0,42.0)△42.0(38.0,47.0)△▲44.440<0.001SDS28.0(26.0,30.2)36.0(33.0,51.5)△50.5(42.0,61.0)△▲44.016<0.001 注:与健康对照组比较△P<0.05;与DSE组比较▲P<0.05

表4 DSE组认知及情绪损伤与免疫指标的相关性指标CD4+rsP值CD8+rsP值IL-1βrsP值IL-6rsP值TNF-αrsP值MoCA-0.1990.2750.2130.2420.0560.7610.0940.6080.2950.101MQ0.0240.8980.0330.8580.0150.937-0.1310.4760.1010.582数字符号0.0240.896-0.1630.3720.0420.8200.0550.7650.0850.642Stroop(色)-0.1270.4900.1770.3320.1710.3500.2850.1140.3120.082SAS0.2110.247-0.0040.9810.0800.6630.0340.8550.1470.422SDS0.1280.4840.1150.5310.1920.2940.1420.4370.3820.067

表5 DRE组情绪及认知功能损伤与免疫指标的相关性指标CD4+rsP值CD8+rsP值IL-1βrsP值IL-6rsP值TNF-αrsP值MoCA0.752<0.001-0.0140.946-0.6130.001-0.6130.001-0.4450.023MQ0.5320.005-0.0670.743-0.4770.014-0.672<0.001-0.4620.017数字符号0.4500.0210.2730.177-0.2320.253-0.0950.645-0.1740.394Stroop(色)0.4460.022-0.0250.902-0.1080.600-0.2300.259-0.1130.581SAS0.0640.7570.2640.192-0.0730.723-0.1550.4510.1100.592SDS-0.3700.0630.0860.6780.5730.0020.4040.0410.4230.031

3 讨 论

认知及情绪损害与T淋巴细胞亚群、细胞因子之间的相关性是近年来的研究热点，在针对帕金森病、Alzheimer’s病、血管性痴呆等多种认知障碍疾病的研究[9-11]发现，免疫炎症指标与认知情绪损伤具有一定的相关性，提示免疫炎症指标可能在早期筛查认知情绪损伤中具有重要的临床价值，但有关免疫炎症指标用于癫痫相关性的认知情绪损伤的研究目前鲜少报道。本研究通过比较DRE组、DSE组及健康对照组之间的免疫炎症指标，认知、心理功能检测结果，揭示了DRE患者T淋巴细胞亚群、细胞因子变化与认知及情绪损伤的相关性。多数癫痫患者可以通过合理用药有效控制癫痫发作和进展，但临床统计显示约三分之一的患者易发展为DRE[12]，认知功能障碍是DRE极为常见的一种并发症,大约70%～80%的DRE患者存在明显的认知功能缺陷[2]。本研究发现，相较于DSE及健康对照组，DRE患者MoCA、MQ、数字符号转换实验、Stroop字色测试等量表评分结果均出现明显下降，充分表明DRE患者存在记忆力、注意力、执行功能等多方面的认知受损。情绪障碍是癫痫患者最常见的共病之一，约10%～60%的患者会出现情绪心理障碍，且最常表现为焦虑和抑郁情绪障碍[13]。本研究发现，癫痫患者的SAS、SDS评分明显升高，并且，DRE患者评分结果高于DSE患者，提示DRE患者普遍存在情绪抑郁及焦虑情况。认知及情绪障碍会严重影响患者生活质量，导致患者生存水平、社会功能下降，造成巨大的家庭和社会负担，而寻找新的免疫标志物有助于临床医生筛查伴有认知及情绪障碍的癫痫患者，从而尽早的做出干预及治疗。

有临床研究[14-16]证实免疫异常参与癫痫的发病过程，且癫痫患者存在明显的T淋巴细胞群紊乱情况。本研究结果发现，DSE患者CD4+T淋巴细胞百分比、CD8+T淋巴细胞百分比明显低于健康组，而DRE患者上述指标明显低于药物敏感组和健康对照组，进一步将免疫指标与神经心理学量表评分结果行相关性分析，提示药物敏感组各指标间无明显相关性，而耐药组CD4+T淋巴细胞百分比与MoCA、MQ、数字符号转换测试、Stroop(色)评分结果呈明显的正相关，即CD4+T淋巴细胞下降可能参与DRE患者的认知损伤，但具体机制尚不明确。有学者[17-18]认为循环T细胞在大脑和智力功能(包括认知能力和神经发生)中发挥支持作用。通过脑膜血管内皮P-选择素可介导外周CD4+T淋巴细胞进入脑膜间隙，当外周CD4+T细胞缺乏时，可导致脑膜间隙CD4+T的减少，而脑膜间隙中CD4+T细胞的耗尽会导致学习和记忆障碍。最近的研究[19]表明，在缺乏CD4+T细胞的情况下，脑膜髓样细胞获得了一种促炎表型。这些促炎的髓样细胞产生细胞因子，从而对认知产生负面影响。也有人提出，CD4+T细胞是额外脑源性神经营养因子(BDNF)的来源，因此可能促进成人神经发生。有实验[20]证明，CD4+T细胞耗竭的小鼠脑内BDNF的产生减少。小鼠神经发生的减少可能部分是由于大脑中BDNF的产生减少所致。还有一种可能的机制是外周CD4+T细胞的缺乏可以影响突触前蛋白编码基因的表达，这些蛋白参与快速神经递质释放并可能有助于记忆表现[21]。除此之外，CD4+T细胞在维持大脑稳态中发挥关键作用，CD4+T细胞的缺失可以导致大脑稳态失衡，从而产生认知障碍[22]。外周免疫缺陷导致认知功能障碍，这种认知损伤可以通过补充T细胞逆转，进一步证实了T细胞是参与认知的关键免疫细胞[23]。有临床研究[24]认为T细胞的缺失对情绪健康有破坏性影响，广泛用于器官移植的T细胞定向免疫抑制肽也被证明会在患者和实验动物中诱发一系列神经心理问题，包括抑郁和焦虑。化疗也通常会导致急性心理并发症可能。可能是样本量较小原因，本研究中未发现T细胞缺失与情绪损伤有关，未来需更多的临床实验和系统性的研究进一步探索和证实。

细胞因子是免疫反应的重要介质，在CNS兴奋性改变和癫痫发作中发挥重要作用[25-26]，并可能参与癫痫病理学改变[6,27-28]。相关报道[29]指出，癫痫患者普遍存在外周血慢性炎症反应。本研究通过对各组间细胞因子水平的比较发现，IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子水平在DSE患者中明显升高，而DRE患者升高更为显著，分析上述细胞因子与神经心理学量表评分之间的相关性，尚未发现DSE组各指标间具有明显相关性。但DRE组的细胞因子水平与MoCA、MQ量表评分呈明显的负相关，与SDS呈明显的正相关，进一步证明促炎细胞因子水平在DRE患者认知及情绪损伤中可能发挥重要作用。这与既往研究[17]中认为致炎细胞因子水平升高会对学习、记忆、神经可塑性和神经发生产生不利影响的观点一致。癫痫发作可导致血-脑屏障破坏，IL-1β和其他炎症细胞因子可与影响紧密连接和基底膜的内皮细胞受体相互作用，从而改变血-脑屏障的通透性，而血-脑屏障通透性的改变可能有利于细胞因子进入CNS。这种细胞因子信号可以触发中枢炎症反应并激活小胶质细胞，诱导和传播同样的细胞因子信号到整个CNS[30]。此外，血-脑屏障在允许某些细胞因子进入的倾向方面并不统一：位于海马突起附近的隔膜后部被证明是IL-1β和TNF-α的高度首选入口点，这解释了细胞因子影响认知和记忆的神经解剖学机制[9]。据近期报道[31]，高水平的IL-1β、IL-6、TNF-α可损害海马长时程增强作用(LTP)的诱导和维持，导致LTP的抑制。脑细胞因子的升高进一步激活了应激反应系统，特别是下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感神经系统，导致正反馈回路的激活，产生高水平的皮质醇和单胺，激活了各种细胞机制，导致学习和记忆受损，神经可塑性和神经发生受抑[32]。炎性细胞因子还可以导致BNDF、神经生长因子下降，这似乎是炎性细胞因子影响神经发生、导致认知功能障碍的另一可能机制[33-34]。IL-1β对神经发生的影响至少涉及两种机制。第一种是间接的，通过IL-1诱导的糖皮质激素分泌[35]。第二种机制涉及到IL-1通过IL-1R1直接作用于海马亚颗粒区的神经前体细胞，抑制海马神经发生[36]。IL-6除了可以抑制神经发生外，已被证实对神经可塑性有不良影响。IL-6似乎同时导致神经元存活率的下降和神经元分化的减少[37]。另一项研究[17]发现，高水平的TNF-α会导致神经细胞死亡。通过TNF受体Ⅰ型的信号传递，TNF-α抑制了神经发生过程，并推动神经前体细胞向星形细胞分化。本实验通过促炎细胞因子与焦虑抑郁评分结果的相关性分析，表明炎性细胞因子可能参与抑郁情绪的发生与发展。研究[38]表明，给予致炎细胞因子可诱导出与自然发生的抑郁症极其相似的状态，抑郁症与炎症标记物IL-1β、IL-6和TNF-α之间存在剂量-反应关系。本研究也证实了DRE患者抑郁量表评分与IL-1β、IL-6和TNF-α呈正相关。细胞因子在抑郁症中的作用最早是由Smith以“抑郁症的巨噬细胞理论”的形式提出的。IL-1β等炎性细胞因子参与抑郁样病理生理学的一种解释是炎性细胞因子可以抑制中缝5-羟色胺神经元的放电，抑制5-羟色胺能神经传递[39]。有趣的是，有证据表明抑郁情绪与海马神经发生受损和BDNF表达减少有关，而这两者都受到外周白细胞及细胞因子的严格调节[22]。

本研究证实，DRE患者T淋巴细胞亚群、细胞因子与认知及情绪障碍具有一定相关性。目前已有研究[40]证明体内细胞因子受体失活可以防止记忆和空间学习缺陷。有临床试验[41-42]表明，IL-1拮抗剂，托西珠单抗等在治疗难治性癫痫患者上取得了一定疗效。这为临床医生提供了一种新的思路，或许细胞因子拮抗剂的应用可以在一定程度上延缓认知及情绪的恶化进程，这需要将来有更多的临床实验进一步研究和探索。

本研究的不足之处在于仅对DRE患者的免疫炎症指标与神经心理学量表评分之间进行了相关性研究，未把病程、发作频率、服用抗癫痫药物等影响认知功能的因素纳入统计。除此之外，研究的样本量偏小。

综上所述，通过神经心理学测评，本研究发现DRE患者存在普遍的焦虑抑郁情绪，在认知功能上也表现出明显的下降，包括记忆力、注意力、执行功能等。同时，通过对DRE患者外周血T淋巴细胞亚群及细胞因子水平的测定发现，DRE患者更容易出现免疫状态紊乱情况。DRE患者认知及情绪障碍可能与T淋巴细胞亚群失衡及细胞因子相关。通过对外周血相关免疫指标的评估，有助于医生尽早发现患者的认知及情绪障碍，以便采取合理有效措施预防或延缓认知及情绪障碍的发生发展。