深空探测器表面采样技术适应性研究

陈宏博，张兰涛，袁俊霞，党 磊，印 红，邹乐洋，徐侃彦

（1. 航天神舟生物科技集团有限公司； 2. 中国航天科技集团有限公司 空间生物工程研究中心；3. 北京市空间生物工程技术研究中心：北京 100086； 4. 北京空间飞行器总体设计部，北京 100094）

0 引言

探索和寻找地外生命一直是宇宙生物学的主要科学目标之一。在深空探测任务中，避免造成对目标星体的“前向污染”是行星保护工作任务的重要目标。在深空探测器研制过程中，通过对探测器硬件进行清洁、灭菌以及二次污染防护等微生物控制措施可以保障探测器的生物负载符合行星保护要求。“海盗号”火星探测器采取了美国深空探测任务以来最严苛的微生物控制措施，组装完成后在(111.7±1.7) ℃的高温条件下进行了23～30 h 的整器干热灭菌。然而，随着深空探测任务的复杂性增加，对现代探测器进行系统级干热灭菌已不适用，因此，在研制过程中持续对探测器硬件中可能存在的生物负载数量和种类进行检测显得更加重要。产芽孢微生物是行星保护任务中重点关注的微生物类群，探测器硬件负载的芽孢数量也被用于表征探测器的微生物污染程度。

自“海盗号”任务起，NASA 逐渐建立了一套标准操作文件（NASA-HDBK-6022）用于指导航天器硬件表面的微生物采样与检测。其中的具体操作程序是：使用采样拭子或采样擦巾从航天器硬件表面采集微生物样本，经过洗脱后将样品进行热激处理（80 ℃，15 min）以杀死营养体细胞，然后利用TSA（胰蛋白胨大豆琼脂）培养基对微生物进行培养和计数。大量的研究表明：硬件材料表面特征和拭子选型是影响微生物采样和检测效率的两种主要因素。在早期任务中，NASA 采用的拭子主要为棉拭子，而利用棉拭子采集痕量微生物时，大部分样品被捕获在拭子头部的纤维基质中而不易释放，样品回收率降低。近年来，棉拭子已逐渐被植绒拭子取代。植绒拭子通过静电电荷将尼龙纤维垂直固定，使拭子采集区域内部无吸收孔，样品不会分散滞留在纤维中，有利于更高效的洗脱。植绒拭子在微生物采集的准确性、精密度、检测限等方面的优势已得到验证。ESA 在深空探测任务中，针对探测器硬件负载的微生物数量也进行了系列检测工作，以植绒拭子为对象，制定了标准操作文件ECSS-Q-ST-70-55C。

我国近年也在航天器研制任务中开展了一系列微生物采集与检测工作，并建立了相应的试验体系。本文结合我国深空探测器硬件表面微生物采样工作的实际经验与需求，以拭子的采集效率为重点关注指标，对比了两种植绒拭子（一种欧洲产，一种国产）对不同材料表面、不同产芽孢菌的采集效率。研究结果将为我国开展深空探测器硬件表面微生物检测提供数据和技术支持。

1 试验材料与方法

1.1 拭子选型

本文共选用两种植绒拭子进行测试（见图1）：一种为意大利Copan 公司产的FLOQSwabs Copan 552C 尼龙植绒拭子，是ESA 在探测器硬件表面微生物采样中常用的植绒拭子；另一种为型号CY-93050T 的国产植绒拭子。每个植绒拭子都是无菌单独包装，且预置断裂点以能够轻松折断从而直接进行后续试验处理。对两种拭子的扫描电镜观察结果显示，拭子上的单纤维从拭子头突出，大小均匀；FLOQSwabs Copan 552C 植绒拭子的尼龙纤维平均直径(19.01±0.25) μm（见图1(a)），CY-93050T 植绒拭子头结构更紧凑，尼龙纤维分布更规整，平均直径(17.89±0.44) μm（见图1(b)）。扫描电镜的型号为FEI Quanta250 环境扫描电子显微镜。

图1 两种植绒拭子的扫描电镜图像Fig. 1 SEM images of two kinds of nylon flocking swabs

1.2 受试材料

本文共针对两种不同表面光洁度的硬件材料（见图2）进行测试，分别是表面光洁度高的铝合金5A06 和表面光洁度较差的阻燃混纺斜纹布（规格205 g/m）。

图2 铝合金5A06 和阻燃混纺斜纹布的扫描电镜图像Fig. 2 SEM images of 5A06 aluminum alloy and flame retardant blended twill

试验前，将受试材料剪裁为表面积为50 mm×50 mm 的测试片，分别用含有1%非离子去污剂Triton X-100 的热水、蒸馏水对受试材料进行表面清洗，采用99.5%试剂纯级的异丙醇再次冲洗并沥干，用铝箔纸包好，175 ℃干热灭菌80 min 后备用。

1.3 菌种选择

本文选择2 种产芽孢菌的芽孢态休眠体（见图3）进行测试，即萎缩芽孢杆菌ATCC 9372和解淀粉芽孢杆菌B30175。其中：ATCC 9372 是常用的标准测试菌株，同时也是我国AIT 厂房环境中常见的微生物类群；B30175 是从我国AIT 环境中分离的优势微生物菌株。试验过程中，受试芽孢的出发菌液浓度控制在4×10CFU/m。

图3 两种芽孢杆菌的图像Fig. 3 Images of the two kinds of bacillus

1.4 试验方法

所有的微生物采样操作均在生物安全柜中进行。将100 μL 菌液（约100 CFU）均匀滴在材料片的表面区域，在生物安全柜中晾干。取出无菌植绒拭子，将拭子的头部在无菌蒸馏水中润湿后，以“S”型在材料表面进行微生物采样，完成后，将拭子头折断放入无菌蒸馏水中。

用超声波清洗仪对拭子超声洗脱2 min 后用无菌水梯度稀释洗脱液，取0.5 mL 稀释洗脱液加到培养皿中，向洗脱液中加入约20 mL 熔化的R2A琼脂培养基，室温下放置至培养基凝固，32 ℃下倒置培养，于24 h、48 h 和72 h 后进行菌落计数。

试验过程中，分别设置阳性与阴性对照组。阳性对照组不进行采样操作，将等体积的出发芽孢菌液直接进行培养，计算出发菌落数量；阴性对照组是将拭子在生物安全柜的空气中挥动2～4 s 后进行洗脱、培养与计数。

本研究所有的试验组均进行3 次重复试验，每次试验设置3 个平行样品。

1.5 数据统计与分析

每个试验组中采集效率=(试验组微生物菌落数/对照组菌落数值)×100%，菌落数使用培养72 h后的累计菌落数进行计算。平均采集效率以均值±标准偏差（±）表示。使用SPSS21.0 软件对每个试验组的采集效率进行独立样本T 检验，进一步采用多重方差分析评估拭子、受试材料和菌种对微生物采集效率的影响。两种拭子的采集效率差异水平用值描述：若＜0.001，表示差异达到极显著水平；若＜0.05，表示差异达到显著水平，具有统计学意义。

2 结果与分析

将两种产芽孢菌的菌液分别分散在受试材料表面，并按照1.4 节所述方法分别用Copan 552C 植绒拭子和CY-93050T 植绒拭子进行微生物采集。经培养计数和统计分析后的采集效率结果如图4所示：Copan 552C 植绒拭子的采集效率为13.43%～42.78%，平均采集效率为29.43%±8.2%；CY-93050T植绒拭子的采集效率介于17.87%～63.78%，平均采集效率为45.38%±13.46%。CY-93050T 植绒拭子的采集效率高于Copan 552C 植绒拭子，显著性分析结果显示：除斜纹布+组外，其余处理组内Copan 552C 植绒拭子与CY-93050T植绒拭子的微生物采集效率差异均达到显著水平。

图4 不同拭子的微生物采集效率比较Fig. 4 Comparison of the collection efficiency among different swabs

2.1 拭子种类对采集效率的影响

拭子是影响微生物采集效率的主要因素之一。尼龙纤维材料的拭子可促进微粒和微生物的释放，从而显著提高微生物采集效率，展现出比棉拭子更优良的性能。NASA 标准程序中棉拭子的采集效率仅为13.2%；Rose 等利用棉拭子对芽孢杆菌的芽孢采集效率可达到 41.7%，但由于棉拭子有一定的有机性质，可能会引起探测器硬件表面出现残留问题；Probst 等使用两种植绒拭子从不锈钢试样中采集萎缩芽孢杆菌芽孢，采集效率分别达到了达到45.4%和49.0%。本文采用的CY-93050T 植绒拭子对铝合金表面的采集效率可达54.90%±6.93%，高于几种国外拭子的采集效率，在后续工作中可作为我国开展相关探测器硬件表面生物采集工作的备选拭子。

2.2 受试材料对采集效率的影响

两种受试材料对微生物采集效率的影响分析结果如表1 所示，可见拭子对对铝合金表面的平均采集效率高于斜纹布表面的。造成两种受试材料表面采集效率差异的重要原因是铝合金与斜纹布不同的表面光洁度。铝合金具有较高的表面硬度和光洁度，在工程制造中通过抛光、表面涂层等方法可以大大降低微生物黏附，采集效率较高。相比之下，斜纹布表面的嵌套结构、多孔结构较多，进行微生物采集难度较大，采集效率也会偏低。Buttner等研究也证明对产芽孢微生物的采集效率与材料表面的光洁度相关：在光滑的碳纤维增强塑料表面采样时，采集效率可达到62.0%；但当在粗糙表面采样时，采集效率下降到26.6%；而在表面更粗糙的Vectran 纤维上采样时，采集效率仅能达到5.9%～8.8%。针对这种表面粗糙的材料，在后续采样过程设计中应加强对拭子材质和拭子头尺寸形状的关注，选择在粗糙材料表面微生物采集效率较高的拭子。

表1 拭子对两种材料的采集效率Table 1 The collection efficiency of flocking swabs on two kinds of materials

2.3 菌种对采集效率的影响

进一步分析两种不同芽孢杆菌对采集效率的影响，统计分析结果如表2 所示：拭子对B30175 的平均采集效率高于ATCC9372 的。由此可见，菌种也是影响受试材料表面微生物采集效率的重要因素。Dalmaso 等用拭子分别对接种了芽孢杆菌、念珠菌和曲霉菌的不锈钢片进行采样，发现不同菌种对应的采集效率范围介于42%～66%，有明显差异，分析其原因，是因为微生物菌株独特的理化特征，微生物在不同材料表面黏附的行为特征存在差别，如一些能够分泌胞外物质的微生物更易黏附在材料表面，这就加大了拭子采集的难度，也造成了不同菌种下采集效率的差异。

表2 拭子对两种芽孢杆菌的采集效率Table 2 The collection efficiecy of flocking swabs for two kinds of Bacillus

2.4 影响微生物采集效率的因素交互作用分析

利用多因素方差分析评估拭子、受试材料和微生物菌种对采集效率的影响，结果如表3 所示，其中值为方差的统计量。可见：拭子、受试材料和微生物菌种作为主效应因子对微生物采集效率都有显著性影响；此外，结果显示受试材料与菌种间存在交互作用，两者的交互效应对微生物采集效率存在显著影响。采样拭子与受试材料之间、采样拭子与微生物菌种之间以及采样拭子、受试材料与微生物菌种三者之间则未检测到存在交互作用。实际采样过程中应重点关注优势微生物类群的采集效率，选择适用于我国探测器常用材料的采样拭子，进而保持试验体系、操作的稳定性，降低系统误差，确保对环境微生物追踪数据的稳定性和可比较性。

表3 影响微生物采集效率的因素交互作用分析（样本数n=3）Table 3 Interaction analysis of factors affecting microbial collection efficiency (n=3)

3 结束语

随着我国深空探测任务的推进，国外行星保护任务的既有技术体系与标准已不能完全适用于我国。在行星保护工作中的关键环节——微生物采集与检测中，未来应加大对我国自产拭子的选型与测试：除了关注拭子的回收效率、洗脱效率等基础参数外，还应重点关注拭子对航天器负载的微量/痕量微生物的采集性能。同时，应以我国现有探测器研制任务为基础，分析探测器的材料选型、结构设计、研制流程等特征，逐步建立和完善适用于我国探测器常用材料与结构的微生物采样与检测技术体系、规范与标准，实现我国在探测器研制过程中的生物负载量可检测、可追溯、可控制的任务目标。