基于反射式成像光路的全波段蛋白检测仪的研制

张亚兵，戴 博

（上海理工大学 光电信息与计算机工程学院，上海 200093）

引 言

酶标仪又名酶联免疫检测仪，是对酶联免疫吸附实验结果进行读取和分析的专业医学仪器。免疫蛋白检测包括酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）、二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA）、蛋白质浓度测定实验等[1-2], 是近些年来普遍应用于心血管疾病[3]等早期疾病诊断的以蛋白质作为生物标志物的检测方法[4-5]。酶联免疫反应通过结合在抗原或抗体上的酶催化显色底物发生反应，反应结果以颜色的深浅进行显示，溶液颜色的深浅值对应吸光度值的大小，以此来判断溶液样本中待测抗体或者待测抗原的浓度[6]。酶标仪广泛应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学等领域。ELISA是一种定性和定量的检测方法，其中检测机制为可溶性的抗原或抗体会因为抗原和抗体结合的专一性发生免疫反应，而抗体或抗原会先与聚苯乙烯等固相载体结合。BCA蛋白浓度检测实验则是基于溶液颜色深浅相对应的吸光度值来计算溶液中蛋白质的浓度[7]。酶标仪本质上是一台简单的光电比色计，工作原理和酶标仪一样都是由滤光片或单色器将光源发出的光转换成一束单色光，该单色光进入酶标板微孔板中的待测样本中，由于待测样本为溶液，会吸收一部分单色光，而其他的光会透过待检测溶液，经过不同浓度微孔板中的溶液后，光电检测器将不同微孔板中的不同强度的光信号进行光电转换，通过上位机进行数据处理和计算得到实验结果。酶标仪通过衍射光栅或滤光片选择不同波长的光与待测溶液的吸光度相对应的某一波长的光，使用由电机控制的光电探测元件来逐一扫描酶标板上的微孔[8-9]。传统酶标仪光学系统笨重且复杂，加上机器内部的机电转换装置，导致仪器的体积大，成本高，检测效率低，衍射光栅或滤光片价格昂贵[10]，且只有专业的人员才能完成精密仪器的操作和实验结果的分析。

本文研制了基于反射式成像光路的全波段蛋白检测仪，分别进行了PTX3酶联免疫吸附实验和BCA蛋白浓度检测实验，两个实验具有不同的检测波长，实验中使用超广角镜头捕获到实验的待测样本图片后，使用基于图像处理的比色算法对图片进行处理与分析，能够快速准确地实现380～750 nm波段蛋白浓度的检测，同时降低了仪器使用滤光片或光栅的昂贵成本，通过与商用酶标仪的检测结果进行对比，验证了全波段蛋白检测仪的可行性。

1 基于反射式成像光路的全波段蛋白检测仪

1.1 硬件系统

图1（a）、（b）分别为全波段蛋白检测仪的外部结构图和内部结构图。仪器的检测机制为将含有样本的酶标板放入全波段蛋白检测仪中，打开LED光源，光透射经过样本，一部分被溶液吸收，另一部分光经反射镜改变光路，由广角镜头和CCD捕获。CCD将光信号转换为电信号，传输至上位机，上位机进行数据图像处理，将图片中的溶液颜色信息转换为待检测样本的蛋白浓度信息。

图1 全波段蛋白检测仪的内外部结构Fig. 1 Internal and external structure of a full band protein detector

光学成像系统包括LED光源、匀光板、前表面镀膜反射镜、超广角镜头、CCD。LED光源是由96个LED灯组成，且与酶标板的96微孔一一对应，LED灯的光谱可以全面覆盖380～750 nm的可见光范围，峰值波长为481 nm，LED光源通过匀光板使光强更加均匀、稳定，匀光板采用双面磨砂1.2 mm厚度，透射率为90%，透射雾度为98%。反射镜采用前表面镀膜技术，保护膜的厚度为250 nm，反射率为99.67%，采用焦距为12 mm，视场角为100°的镜头。在成像系统中，为了提高成像的视场范围，往往会造成较大的光程，从而造成较低的空间利用率。全波段蛋白检测仪采用反射式光学检测的方式进行成像[11]，将一维成像光程扩展为二维，提高维度减少空间，同时提高视场范围，光程从原来100 cm减小到60 cm，使系统更加紧凑，架构更稳定，成像系统的光路模拟图如图2所示。

图2 成像系统光路模拟图Fig. 2 Optical path simulation of the imaging system

电路系统是由USB HUB、GPIO （generalpurpose input/output）控制器、继电器和电源组成。电路系统控制光源和成像系统，并通过上位机软件进行操控，实现点亮光源、摄像机拍照的功能，以获取酶标板微孔板中样本溶液颜色信息图来进行后续的数据图像处理功能。机械部分是由外壳、底座、酶标板安装架、镜面支撑架、相机固定架构成。仪器外壳采用3D打印技术使用环氧树脂材料，其他部分均使用铝合金材质。酶标板固定架通过伸缩弹簧和限位螺丝保证酶标板的放入弹出以及位置的固定。

1.2 软件算法

全波段蛋白检测仪获取到检测样本图片后，将图片传输至上位机，上位机将获取的图片转换为归一化的RGB颜色空间，减少光照强度对成像的影响。Human Pentraxin 3/TSG-14酶联免疫吸附实验完成后溶液颜色为蓝色，加入终止液后变为黄色，光的吸收检测波长为450 nm，所以选择蓝色通道来对显色溶液后的图片通过基于图像处理的比色算法来获取图片中溶液的质量浓度信息。BCA蛋白浓度检测实验的溶液颜色为紫色，溶液对应的光吸收度的检测波长为562 nm，因此选择归一化的绿色通道分析[12-13]。

PC端的程序是由Visual Studio 2019软件来实现的，程序的功能包括对全波段蛋白检测仪的光源以及成像模块的控制以及OD （Optical Density）值、浓度信息的获取及界面显示。图像处理比色算法流程如图3所示，首先，获取酶标板中96孔微孔板的中心，并求得每个微孔的像素均值，由于每个微孔加入的样本体积是一致的，因此以中心区域的像素均值作为样本浓度的指标。微孔板中的像素取值范围为0～255，使用微孔的像素均值作为标准曲线的纵坐标，以待测样本浓度作为横坐标使用基于四参数拟合模型来绘制标准曲线，并由标准曲线来分析未知样本的浓度信息。

图3 图像处理比色算法Fig. 3 Colorimetric algorithm

2 实验与验证

2.1 试剂与仪器

实验中所用的试剂及仪器包括：Human Pentraxin 3/TSG-14检测试剂盒（产品编号DPTX35）；Pierce™ BCA蛋白质量浓度测定试剂盒（Thermo Fisher，产品编23225）; 稀释液（PBST，Thermo Fisher）；基于反射式成像光路的全波段蛋白检测仪；移液枪（Eppendorf AG）；Infinite M200 商用酶标仪（Tecan）；超纯水机（上海和泰公司）；TRIO TM-2N振荡器（ASONE）。

2.2 PTX3酶联免疫吸附实验

先用移液枪向96孔酶标板的每个微孔中加入200 μL一抗，在20 ℃的室温下，将装有待测样本的酶标板放入振荡器中培养60 min。培养60 min后，向微孔中加入400 μL的PBST重复洗涤微孔2次，洗涤完成后，移出多余的PBST，并将酶标板翻转，将残留的PBST拍出，然后向需要的微孔中加入100 μL的测定稀释剂RD-156和20 μL 的待测样本，使用试剂盒中的透明封板纸密封酶标板，在室温下培养2 h。培养完成后使用PBST重复洗涤微孔4次，向相应的微孔中加入200 μL酶标检测抗体，室温下培养2 h。孵育完后将微孔洗涤4次，并将酶标板翻转，将残留的PBST拍出，向酶标板的每个微孔中加入200 μL结合液，并将酶标板放在避光20 ℃的环境下培养30 min。最后，向对应的微孔中加入50 μL终止液，在15 min内测量反应产物。PTX3酶联免疫吸附实验按照试剂盒说明书中的实验步骤进行操作。实验采用96孔透明酶标板，制作两列相同浓度的标准品，每列设置8个标准品，两列标准品质量浓度递减，质量浓度范围为0～20 ng/mL；并检测16个未知样本中的PTX3蛋白浓度，实验完成后采集的图像如图4所示。

图4 PTX3实验图像Fig. 4 PTX3 experimental result

2.3 BCA蛋白浓度测定实验

使用96孔酶标板进行BCA蛋白测定实验，实验中做出两列浓度相同的标准品，其中包含2个空白对照孔。BCA蛋白浓度实验中检测40份未知样本的蛋白浓度。按照试剂盒中的说明书中的表格进行标准品的稀释，并依次稀释出一组有质量浓度梯度的BCA蛋白质标准品，其中，质量浓度范围为20～2 000 μg/mL。把试剂盒中的试剂A和试剂B按照说明书的比例即50∶1，混合均匀制作工作液。然后使用移液枪向每个微孔中加入25 μL的标准品或未知样本，并依次向每个微孔中加入200 μL的工作液。将酶标板放在振荡器上使用400 r/min 震荡30 s，将样本和工作液充分混合，将混合后的酶标板放入37 ℃的恒温培养箱中培养30 min，待96孔酶标板冷却至室温，使用酶标仪换入562 nm的滤光片检测酶标板微孔中蛋白浓度。使用商用酶标仪检测完成后，用同样的方式采集全波段蛋白检测仪获取BCA实验后的图像如图5所示

图5 BCA蛋白浓度测定实验图像Fig. 5 The experimental result of BCA protein testing

3 结果与讨论

3.1 标准曲线

Human Pentraxin 3/TSG-14酶联免疫吸附实验和BCA蛋白浓度测定实验均适用于合四参数拟合模型[14-15]，而未知样本质量浓度和响应的关系用四参数拟合模型可表示为

式中：y为样本在蓝色通道下的响应值；x为质量浓度；a为下渐近线估值，b为曲线斜率值，c为质量浓度对应于最小响应与最大响应估计值之间的中间值；d为曲线的上渐近线估值。

全波段蛋白检测仪通过四参数拟合模型绘制的标准曲线与商用酶标仪的测试结果进行对比，评估仪器的性能。

通过图6可知，PTX3实验中，全波段蛋白检测仪根据OD值拟合的标准曲线拟合优度(R2)为0.999 6，而商用酶标仪根据OD值拟合的标准曲线的拟合优度为0.999 8。图7为BCA显色实验结果图，根据OD值拟合的标准曲线拟合优度为0.999 7，而商用酶标仪根据OD值拟合的标准曲线的拟合优度为0.999 8。由实验数据表明全波段蛋白检测仪使用比色算法绘制的PTX3 实验的标准曲线以及BCA蛋白浓度测定实验的标准曲线与商用的酶标仪绘制的标准曲线基本一致，且拟合优度较高，全波段蛋白检测仪性能达到检测要求，并能够完成多波段的生物显色实验。

图6 PTX3标准曲线 实线代表标准曲线：商用酶标仪虚线代表标准曲线：全波段蛋白检测仪Fig. 6 PTX3 standard curve. Solid line: standard curve measured from the commercial microplate reader. Dotted line:standard curved measured from the full-band protein detection system.

图7 BCA标准曲线 实线代表标准曲线：商用酶标仪虚线代表标准曲线：全波段蛋白检测仪Fig. 7 BCA standard curve. Solid line: standard curve from the commercial microplate reader. Dotted line: standard curve measured from the full-band protein detection system

3.2 未知样本分析

实验用42份未知样本进行PTX3实验和40份未知样本进行BCA蛋白浓度检测实验，根据与之相对应的标准曲线计算未知样本的浓度。图8和图9为全波段蛋白检测仪与商用酶标仪测出的参考质量浓度值的线性关系。两种不同检测波长实验中，基于反射式成像光路的全波段蛋白检测仪与商用酶标仪检测出的结果具有很好的一致性，PTX3酶联免疫吸附实验和BCA蛋白浓度检测实验中测出的两者的样本质量浓度误差在5%以内。

图8 全波段蛋白检测仪与商用酶标仪检测PTX3未知样本质量浓度对比图Fig. 8 Comparison of concentration of unknown PTX3 samples detected by the full-band protein detection system and the commercial microplate reader

图9 全波段蛋白检测仪与商用酶标仪检测BCA未知样本质量浓度对比图Fig. 9 Comparison of concentration of BCA unknown samples detected by full-band protein detection system and the commercial microplate reader

4 结 论

在PTX3酶联免疫吸附实验及BCA蛋白浓度测定实验的基础上，采用图像处理比色处理算法，研制出了基于反射式成像光路的全波段蛋白检测仪。经过实验证明，对于不同波长的显色实验，在采集图片之后利用比色算法和四参数拟合模型绘制的标准曲线与商用酶标仪绘制的标准曲线结果基本一致（PTX3:R2=0.999 6，BCA:R2=0.999 7），证明了基于反射式光路的全波段蛋白检测仪能够完成检测。通过反射式的光路设计将一维成像光程扩展为二维，提高维度减少空间，同时延长光程提高视场范围，使仪器架构更加紧凑，同时采用比色算法在3 s内完成检测，而商用酶标仪检测时间大多为10 s，大大减少了检测所需时长，同时降低了使用滤光片或光栅的昂贵成本。