多层螺旋CT灌注成像评价乳腺癌微血管生成的研究

耿鹤群，张志林，张晓辰，梁占东，李永，崔书君

河北北方学院附属第一医院,a 医学影像部，b 放射治疗科，张家口 075000

肿瘤新生血管形成是肿瘤生长和发展过程中的重要生物学行为[1]。实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管形成来供给能量。评价肿瘤新生血管情况对于判断肿瘤的分期、良恶性，评估抗肿瘤疗效及预后均有重要意义。应用目前传统影像技术CT、核磁，只能分辨出直径在200 μm以上的血管[2]。多层螺旋CT(MSCT)灌注成像检查可较好地反映血流灌注情况[3-4]。目前国内MSCT灌注成像检查应用于乳腺疾病的报道尚不多见。本研究对98例(137个)乳腺实质肿块行MSCT灌注成像检查，考察乳腺癌血流灌注特点，分析其与微血管生成(AG)的相关性，探讨将MSCT技术应用于临床评价乳腺实质肿块的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月至2019年12月河北北方学院附属第一医院接诊的98例成年女性乳腺实质性肿瘤患者，年龄19～66岁，因自行或体检做B超检查发现单侧乳腺肿块，病灶最大直径范围0.8～11.0 cm。纳入标准：成年女性；所有患者均有完整的临床资料及手术病理资料；首诊病例，经病理学检查结果确诊；患者均签署知情同意书。排除标准：既往有乳腺实质性病变；乳腺良性增生；乳腺囊肿；乳腺炎性病变；其他部位的恶性肿瘤继发乳腺转移;对本研究中影像学检查不耐受，或对造影剂过敏者；合并基础性疾病，比如心、肝、肾等重大脏器的功能衰竭，不宜纳入临床研究的情况。本研究经河北北方学院附属第一医院伦理会批准。98例成年女性乳腺实质性肿瘤患者病理诊断结果见表1。

表1 98例成年女性乳腺实质性肿瘤患者病理诊断结果

1.2 研究方法

1.2.1 影像学检查 患者均经乳腺超声、钼靶照射检查等，发现单侧乳腺肿块。于其月经结束后的第3～5天分别行常规MSCT平扫和MSCT灌注扫描检查。(1)扫描前：经肘正中静脉穿刺，留置静脉针(18G)。指导患者进行腹式呼吸，确保患者静止不动，在各序列扫描过程中病灶保持同一位置。(2)常规MSCT平扫：于患者吸气末平扫，扫描范围自腋窝顶至乳腺下缘。管电压：120 kV，管电流：100 mA，探测器宽：0.6～64 mm，容积采集重建层厚及间距：7.0 mm。(3)确定病变部位：采用最大层面全肿瘤法，分别选取实质性乳腺肿瘤组织、癌旁正常乳腺腺体组织为兴趣区，选择肿瘤最大中心层面作为灌注扫描层面，选取肿瘤所在最大层面胸主动脉为输入动脉。分别取2～3个感兴趣区测定参数值。(4)MSCT灌注扫描成像：扫描设备是Sensation 64层螺旋CT扫描仪(Siemens西门子公司)。经前臂静脉注入20 mL 0.9%氯化钠注射溶液，确定无渗漏，采用自动高压注射器以6 mL/s速率注入非离子对比剂50 mL(300 mgI/mL),再以同样速率注入20 mL 0.9%氯化钠注射溶液，延迟5 s。行灌注扫描：选择多层连续动态电影扫描模式。扫描分3个序列，每个序列30 s、间隔10 s。扫描中每次球管曝光0.5 s，间隔0.5 s、2.5 s、4.5 s,有效放射剂量=596.7×0.05=29.84 mSv。其他扫描参数的设置与平扫相同。探测器宽度：2～24 mm，重建层厚：7.2 mm。(5)图像后处理：共可得到4×46幅扫描图像，将扫描所得传送至Leonardo图像处理工作站。采用Functional CT中Body Perfiasion体部肿瘤灌注包进行灌注成像数据分析:由软件自动处理数据，得出各兴趣区的灌注参数血管表面通透性(PS)值。

1.2.2 标本取材及免疫组织化学检查 (1)标本取材：全部98例患者均于MSCT检查后3 d内手术。标本取材选取乳腺癌患者肿瘤实质部分(70例,72个单侧病灶)及距标本癌块l cm的无癌浸润的腺体组织(30个,作为对照)，以及乳腺良性实质病变患者的肿瘤实质部分(28例,65个单侧病灶)。标本均经中性甲醛溶液(10%)固定、石蜡包埋和切片(层厚3 m)，再经常规HE染色制成免疫组织化学切片。免疫组织化学检查方法：鼠抗人CD105单克隆抗体试剂盒(产品货号:561439)购自重庆市华雅干细胞技术有限公司。(2)免疫组织化学染色石蜡切片：水浴法修复抗原，磷酸缓冲液(PBS)冲洗后在室温下孵育，加鼠抗人CD105单克隆抗体4 ℃过夜，PBS冲洗后加生物素标记的二抗，再PBS冲洗后加链霉菌抗生素，在过氧化物酶溶液室温下孵育，PBS冲洗后3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)染色，苏木素复染，水性封片剂封片。以已知乳腺癌阳性片为阳性对照；PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判断方法 (1)微血管密度(MVD)：按照Weidner等方法计数[5]。100倍光镜下扫视整个切片，取3个密度最高区，在400倍光镜下(日本尼康双目光学显微镜，ECLIPSE Ci 系列)计数棕红色微血管的数量。单个孤立或多个紧密排列的内皮细胞团，与邻近肿瘤细胞或周围结缔组织分界清楚，无论有无管腔，计为1个微血管数[6]。管径>8个红细胞或伴明显平滑肌脉管，不做计数。(2)Spearman相关性分析：对MSCT灌注成像的各个参数进行定量分析，考察其与MVD的相关性。参数包括：最大密度投影(MIP)、增强平均值(AV)、血流量(BF)、血容量(BV)、血管表面通透性(PS)、Patlak血容量(PBV)。

2 结果

2.1 不同乳腺组织MSCT灌注成像参数比较 乳腺癌组织MSCT灌注参数PS、MIP、AV、BF、BV、PS、PBV均值分别都高于乳腺良性实质肿块组织和乳腺癌旁正常乳腺组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同乳腺组织MSCT灌注成像参数比较

2.2 不同乳腺组织标本MVD比较 400倍镜下单个视野中,乳腺癌组织的MVD[(24±7)个]明显高于乳腺良性实质肿块组织[(2±1)个]及乳腺癌旁正常乳腺组织[(1±1)个]，差异有统计学意义(F=503.051，P<0.001)。

2.3 MSCT灌注成像参数与MVD的相关性 乳腺癌MSCT灌注成像参数中，MIP(r=0.42)、AV(r=0.44)、BF(r=0.49)、BV(r=0.47)、PS(r=0.48)、PBV(r=0.45)与MVD均呈正相关(P值均<0.05)。

3 讨论

乳腺癌是血液供应丰富且表面通透性高的恶性肿瘤类型[7]。乳腺癌肿瘤浸润和转移是复杂的演变过程，其中肿瘤新生血管生成是恶性肿瘤生物学行为的营养保障。乳腺癌存在大量增加的新生肿瘤血管，这些不成熟的血管内皮间隙较正常血管明显增宽，使得内皮细胞之间的连接松散、甚至部分毛细血管壁缺乏内皮细胞，加之肿瘤相关炎症细胞因子等高表达，导致血管基底膜的完整性被破坏，因而肿瘤血管通透性增加。

CT灌注成像是一种可以定量分析肿瘤血管生成情况的成像方法,其可较好地反映肿瘤血管状态，量化血管通透性[8-9]。应用MSCT灌注成像检查，可较好地反映血流灌注情况，可避免穿刺活检或手术切除活体组织标本行病理学检查可能给机体带来的诸多不利影响。

肿瘤新生血管与正常血管的功能不同，通透性也是不同的。肿瘤血管越丰富、幼稚性程度越高，其恶性程度越高[10]。不同分级和分期的恶性肿瘤，其肿瘤血管的通透性也不同。一项对Wistar雌性大鼠(n=35) 诱发乳腺肿瘤的动物实验[11]中，应用CT灌注成像(CTPI)技术考察肿瘤血管生成的情况。其结果表明，CTPI可反映肿瘤组织分化程度,有助于判断乳腺病变的良恶性。本研究中对不同性质的乳腺实质性肿块患者均应用了MSCT灌注成像影像学检查技术，考察其血管灌注参数。本研究结果可见，乳腺癌MSCT灌注参数MIP、AV、BF、BV、PS、PBV均值分别都高于乳腺良性实质肿块组织和乳腺癌旁正常乳腺组织(P<0.05)。可见临床应用MSCT技术、监测其灌注参数，可以较好地反映乳腺癌肿瘤新生血管的通透性。乳腺良性实质肿块组织及癌旁正常乳腺组织血管与之相比，呈低灌注的显像，可见通过MSCT参数可以较好地对乳腺实质性肿块的良恶性进行初步评估。如上述乳腺癌MSCT灌注参数的结果，是符合乳腺癌的肿瘤血管通透性增加、MSCT下呈高灌注状态的生物学行为的。乳腺癌的微血管管壁基底膜不完整，细胞间隙较大，可致对比剂外渗，故本研究结果中PS增高，证实了乳腺癌的MSCT灌注成像不同于良性实质肿瘤和正常腺体组织。另外，研究显示，乳腺癌组织可能通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)而促进肿瘤血管的生成[12-13]。本研究结果中，乳腺癌组织MSCT灌注成像参数BF、BV增高，提示其血管的高灌注、高渗透，与文献报道[14]也是吻合的。

文献[15]研究中对乳腺癌MSCT灌注成像参数与微血管密度(MVD)的相关性进行了探讨。其研究结果显示，MSCT灌注成像参数中，乳腺实质肿瘤(28个标本)MVD高于良性实质肿瘤(25个标本)及癌旁正常腺体(26个标本) (t=17.67、15.99,P<0.05)，乳腺实质肿瘤MVD与VEGF呈正相关(r=0.82,P<0.05)。该研究结果表明MSCT可作为考察乳腺癌肿瘤血管生成情况的无创性的影像学手段。

MSCT灌注成像可反映肿瘤瘤体的血流动力学情况[16-18]。本研究结果可见，乳腺癌组织MVD高于癌旁正常腺体组织及乳腺良性实质肿瘤组织(P<0.05)，与已有的研究报道[19-20]是一致的。本研究中乳腺癌组织MSCT灌注参数MIP、AV、BF、BV、PS、PBV与MVD均呈正相关(P值均<0.05)，可见应用MSCT灌注成像检查可较好地反映乳腺癌微血管分布情况及其血流灌注的变化。由此提示，利用乳腺MSCT灌注对实质性肿块区域进行定位，指导取活检标本是更有意义的。

此外，MSCT灌注成像能近似地反映肿瘤的血管生成，其对功能性可灌注的毛细血管敏感。但肿瘤的血管生成是复杂的病理过程，可能有毛细血管内皮细胞增生，也可能未生成功能性的管腔化血管。因此，MSCT灌注成像在临床的应用也有其局限性[21]。临床需结合MSCT灌注成像结果及其他常规的影像学检查结果来综合分析做出对乳腺实质性肿块的最终临床诊断结论。本组认为，对于乳腺肿块患者，临床需采取合理的检查手段尽快予以确诊，以便采取相应的治疗措施。新生血管形成是恶性肿瘤的重要生物学行为。借助目前常用的影像检查技术只能分辨出直径在200 μm以上的新生血管形成。MSCT检查可良好地反映血流灌注情况，但有关其在临床应用的研究报道比较少。本研究将MSCT灌注成像检查技术应用于临床，获得了肿瘤新生血管的解剖细节，并经分析获得了MSCT灌注参数与微血管生成的相关结果，故在无创性在体诊断乳腺实质性肿块、鉴别诊断乳腺肿块良恶性方面具有积极的辅助诊断价值，这是本研究的创新点所在。目前尚无乳腺癌患者年龄对MSCT灌注成像技术(参数)影响的相关文献报道。本研究中也未以年龄分层做细致分析，这也提示我们未来可以在MSCT灌注成像相关参数及年龄等对乳腺癌微血管生成评估方面的影响进行深入探索。

综上所述，MSCT灌注成像可作为检测乳腺癌微血管生成情况的一种有价值的无创的影像学手段，其能显示肿瘤新生血管的解剖细节、获得其MSCT灌注参数，可为乳腺实质性肿块的良恶性诊断与鉴别诊断、活检定位等方面提供有价值的血流动力学信息，该检查技术应用简单、可重复操作，图像结果不易受到其他因素的影响。